单细胞生物总结(6篇)
单细胞生物总结篇1
【摘要】
目的探讨中药复方多糖与各单味中药多糖及其含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响。方法制备各中药多糖，并分离服用各多糖后的小鼠血清，分别加入到淋巴细胞悬液中，检测小鼠淋巴细胞增殖情况。结果各多糖组和含多糖血清组均能不同程度的促进淋巴细胞增殖，其中复方多糖和含复方多糖血清组最显著。结论血清药理学方法更能真实地反映药物的药理作用；各单味中药多糖对细胞免疫具有协同促进作用。
【关键词】中药糖含药血清淋巴细胞增殖
Abstract：ObjectiveTodiscusstheeffectofpolysaccharidesoftraditionalChinesemedicineandeachsingleherbalpolysaccharideandmedicatedserumonlymphocytemultiplicationofmice.MethodsVariouspolysaccharidesoftraditionalChinesemedicineswereprepared.Aftertakingvariouspolysaccharides，mouseserumwasseparatedandaddedintolymphocyterespectivelytoexaminelymphocytemultiplication.ResultsAllofthepolysaccharidesandmedicatedserumcouldincreaselymphocytemultiplication，andthetotalpolysaccharideofChineseherbalrecipeanditsmedicatedserumweremostremarkable.ConclusionTheserumpharmacologycanreflectpharmacologicalactionactually;singleherbpolysaccharidehasthecoordinationactiontothecellularimmunity.
Keywords：TraditionalChinesemedicine;Polysaccharide;Medicatedserum;Lymphocytemultiplication
自拟中药复方免疫增强剂由党参、黄芪、当归、熟地等11味中药配伍而成，经临床应用表明该复方对雏鸡有明显增重作用，能显著提高雏鸡成活率和饲料转化率；从该复方中提取的总多糖成分对小鼠免疫功能有显著促进作用［1，2］。本实验采用血清药理学方法，培养淋巴细胞，分别加入服用复方多糖和各单味中药多糖后的小鼠血清和各多糖水溶液，进行淋巴细胞体外增殖实验，初步探讨该复方多糖和11味单味中药多糖对机体细胞免疫功能的影响，以及复方多糖与各单味中药多糖之间的关系。
1材料与仪器
1.1动物昆明种小鼠，8～12周龄，体重18～25g，雌雄兼用，购自石河子大学动物养殖中心。
1.2试剂
MTT、RPMI-1640、标准胎牛血清均购自华美生物工程公司，台朌蓝购自北京拜尔迪生物公司。
1.3仪器酶标仪（BIO-RAD），二氧化碳培养箱（ThermoForma）。
1.4药品实验用的中药复方免疫增强剂是由党参、黄芪、当归、熟地、淫羊藿、茯苓等11味中药配伍而成，各单味中药是从石河子医药公司同次购进，按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方。中药复方多糖和各单味中药多糖由本院中兽医实验室提供。小鼠口服剂量均指经过换算实际进入小鼠体内纯多糖的含量，各多糖用时用蒸馏水配成0.05%的水溶液（5mg/ml），115℃，30min高压灭菌，备用。
2方法
2.1水煎剂的制备按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方，将复方中药粉碎，充分混匀后称取复方中药7.0g，加100ml水煎煮，加热同时不时搅拌，水沸后计时40min后用纱布过滤，收集滤液，在滤渣中重新加入60ml水煎煮，水沸后计时30min，再用纱布过滤弃渣，合并两次滤液，浓缩至140ml，使每毫升水煎剂中含生药50mg。
2.2含药血清的制备［3，4］小鼠随机分为14组，每组10只，实验组分别灌服复方多糖、复方水煎剂以及当归多糖、川芎多糖、淫羊藿多糖、麦冬多糖、何首乌多糖、茯苓多糖、补骨脂多糖、熟地多糖、山楂多糖、党参多糖、黄芪多糖等11味单味中药多糖，对照组灌服生理盐水，每天灌服1次（每次0.5ml/只），连续7d，小鼠于末次灌胃后1h摘除眼球取血，无菌分离血清，同组血清混合后经56℃、30min灭活处理，再用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。
2.3实验分组药物组分为复方多糖组、复方水煎剂组和当归多糖组、川芎多糖组、淫羊藿多糖组、麦冬多糖组、何首乌多糖组、茯苓多糖组、补骨脂多糖组、熟地多糖组、山楂多糖组、党参多糖组、黄芪多糖组以及空白对照组，共14组。
含药血清组也分为14组，即复方多糖药物血清组、复方水煎剂药物血清组、当归多糖药物血清组、川芎多糖药物血清组、淫羊藿多糖药物血清组、麦冬多糖药物血清组、何首乌多糖药物血清组、茯苓多糖药物血清组、补骨脂多糖药物血清组、熟地多糖药物血清组、山楂多糖药物血清组、党参多糖药物血清组、黄芪多糖药物血清组和空白血清对照组。
2.4淋巴细胞增殖试验［5，6］颈椎脱臼处死小鼠，无菌取出小鼠脾脏。200目滤网上捻碎，RPMI-1640液冲洗，收集含脾细胞的冲洗液，1500r/min离心5min。去上清后加入预冷的0.83%Tris-NH4Cl裂解红细胞1min，重复裂解一次，再用1640培养液洗2～3次，弃上清，混匀。台朌蓝染色检测后，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养液（含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素）将脾细胞数调整为6×106个/ml的细胞悬液。于96孔平底培养板中每孔加入100μl细胞悬液，试验组加中药多糖或含药血清，对照组加培养液，每孔做3个重复孔。37℃，5%CO2的培养箱中培养72h，于终止培养前4h，每孔加入10mg/mlMTT溶液10μl，继续培养4h，培养结束后仔细弃去上清，每孔加酸化异丙醇100μl，充分振荡吹打后静置20min，用检测波长570nm参考波长630nm比色分析，用OD值表示结果。
2.5统计学分析所有数据均用SPSS13.0统计学软件处理，组间差异比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1药物组对淋巴细胞增殖的影响
3.1.113个药物组与空白对照组比较，见表1。表1结果表明，13个药物组均能不同程度地增强小鼠淋巴细胞增殖反应，其中复方多糖对淋巴细胞增殖的促进作用最强，与对照组比较差异极显著（P
根据表1结果，13个药物组对小鼠淋巴细胞的增殖的促进作用强弱顺序依次为：复方多糖>复方水煎剂>黄芪多糖>淫羊藿多糖>茯苓多糖>当归多糖>补骨脂多糖>麦冬多糖>川芎多糖>熟地多糖>何首乌多糖>山楂多糖>党参多糖。
3.1.2复方多糖组与复方水煎剂、单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与复方水煎剂组和11个单味中药多糖组比较，复方多糖组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于复方水煎剂组，与之产生显著性差异(P
3.1.3复方水煎剂组与11个单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与组成复方的11个单味中药的多糖组比较，复方水煎剂组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于黄芪多糖组，与黄芪多糖组产生显著性差异（P
转贴于
3.1.411个单味药物多糖组组间比较见表1。由表1可知，11个单味中药多糖组对小鼠淋巴细胞增殖促进程度不同，其中山楂多糖和党参多糖对促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用较弱，与其它9种单味中药多糖间均产生极显著性差异(P0.05)。表113个药物组对淋巴细胞增殖的影响（略）
3.2药物血清组对小鼠淋巴细胞增殖的影响
3.2.113个含药物血清组与空白血清组比较见表2。由表2结果可知，13个药物血清组中，麦冬多糖药物血清、熟地多糖药物血清、山楂多糖药物血清对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较弱，与对照组没有差异（P>0.05），其它10个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖均具有不同程度的增强作用，均与对照组产生极显著性差异（P
根据表2结果，13个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖的促进作用强弱顺序依次为：复方多糖血清组>复方水煎剂血清组>补骨脂多糖血清组>茯苓多糖血清组>黄芪多糖血清组>淫羊藿多糖血清组>川芎多糖血清组>何首乌多糖血清组>当归多糖血清组>党参多糖血清组>麦冬多糖血清组>熟地多糖血清组>山楂多糖血清组。
表内数字右上角*或不同小写字母表示组间比较差异显著（P
3.2.2含复方多糖药物血清组与含复方水煎剂血清、11个含单味药多糖血清组比较见表2。由表2结果可知，与含复方水煎剂的药物血清组和11个含单味中药多糖的药物血清组比较，含复方多糖的药物血清组能显著促进小鼠淋巴细胞增殖，显著强于其它药物血清组，与其它12个药物血清组均产生极显著性差异（P
表内数字右上角*或不同小写字母表示组间比较差异显著（P
3.2.3复方水煎剂药物血清组与11个单味药物多糖组比较见表2。由表2结果可知，与11个含单味中药多糖的药物血清组比较，含复方水煎剂的药物血清能显著促进小鼠淋巴细胞增殖，作用效果强于11个单味中药多糖药物血清组，与11个药物血清组均产生极显著性差异（P
3.2.411个单味药物多糖血清组组间比较见表2。由表2可知，11个单味中药多糖血清组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用存在差异，含补骨脂多糖血清对淋巴细胞的增殖的促进作用最强，补骨脂多糖血清组与川芎多糖血清组、何首乌多糖血清组差异显著(P
另对其它10个单味中药多糖药物血清组的统计分析结果表明，当归多糖血清组与茯苓多糖血清组、山楂多糖血清组差异显著(P
4讨论与小结
测定小鼠淋巴细胞体外增殖反应是研究小鼠细胞免疫功能的重要手段和指标。药物组实验结果表明，复方总多糖、复方水煎剂和11味单味中药多糖均具有不同程度的促进小鼠淋巴细胞增殖的作用，说明这些药物都具有促进细胞免疫功能的作用。其中山楂多糖和党参多糖的促进作用较其他药物组弱，但与对照组比较有显著性差异(P复方水煎剂>11味单味药多糖>对照。
中药血清药理学方法在1987年首次提出，即给予动物灌服中药或复方制剂后，在一定时间内采血，分离血清进行体外药理实验的方法。该方法克服以往中药体外实验的不利因素，比中药直接体外实验有较多的优势，能较客观和真实地阐明中药的药效和作用机制，从而有助于研究中药复方配伍规律和促进中药复方药代动力学研究的深入开展［7］。本试验采用动物含药血清代替中药煎剂和中药多糖进行体外试验，使反应体系更接近于动物体内环境，含药血清组实验结果表明，13个药物血清组中有10组能不同程度地增强淋巴细胞增殖反应，说明这些药物具有很好的免疫增强活性，能够确实增强机体的细胞免疫功能，而麦冬多糖药物血清、熟地多糖药物血清、山楂多糖药物血清对小鼠淋巴细胞增殖反应没有增强作用，这可能与有些有效成分未能从消化道吸收，或因其有效成分经消化道或肝脏代谢失活所致。同时结合以上研究者的报道，认为中药的体内实验和体外实验效果存在不一致性，只有从多方面、多层次、多角度对中药进行研究才能清楚其作用机理。
国内近20年来对大量中草药来源的多糖及糖缀合物，如黄芪多糖、牛膝多糖、猪苓多糖以及枸杞子糖缀合物等近百种多糖进行了化学和广泛的活性研究，相继报道了这些多糖及糖缀合物具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等多方面的药理作用，有的已在临床应用。已有许多研究表明，多糖是许多单味中药产生药效的活性成分。本研究结果表明，复方总多糖和含有复方总多糖的药物血清均对小鼠淋巴细胞体外增殖反应具有显著的增强作用，且其效果分别优于复方水煎剂和含复方水煎剂的药物血清，说明从复方中提取的多糖在增强小鼠细胞免疫功能方面比原复方的水煎剂效果好，本研究从中药及其化学成分对淋巴细胞增殖的影响方面，揭示了复方总多糖为该中药复方的主要活性成分之一，且各单味中药多糖之间存在协同促进作用。
参考文献
［1］罗燕，谷新利，邵永斌，等.中药复方总多糖对小白鼠免疫功能的影响［J］.中兽医医药杂志，2005，24(5):14.
［2］邵永斌，谷新利，罗燕，等.中药复方总多糖及其含药血清对小白鼠免疫功能的影响［J］.中兽医医药杂志，2005，24(6):8.
［3］索晴，崔立然，刘树民，等.黄药子及配伍当归后含药血清抗肿瘤作用的研究［J］.中国中医药科技，2008，15(2):113.
［4］陈长华，方泰惠，周玲玲，等.清络通痹颗粒含药血清对体外培养的成骨细胞和破骨细胞的影响［J］.中成药，2008，30(1):35.
［5］徐艳，郑永唐，何黎，等.昆明山海棠片对小鼠淋巴细胞体外增殖活化影响的研究［J］.中药材，2008，33(4):557.
单细胞生物总结篇2
关键词:蝉拟青霉;总多糖;腺苷;肿瘤;体外
中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1673-7717(2010)04-0760-05
ResearchofAnti-tumorEffectsofDifferentPurifiedComponentsofCordycepsCicadaeinVitro
CAIJufen,JIANGZhiming,LUHongyang,LUBozheng
(ZhejiangCancerHospital,Hangzhou310022,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:Tofurtherstudyanti-tumoreffectinvitroofpolysaccharidesandadenosinerespectively,orcombinedwithcisplatin(DDP)oradriamycin(ADM).Methods:Detectionofinhibitionofhumanlungadenocarcinoma(PAA-1)cellgrowthwithDDP,ADM,polysaccharidesandadenosinerespectivelyorcombinedadministrationbyMTTassay,cellcyclebyflowcytometryonculturedcelllines,colony-formingrateofPAA-1cellinvitrobylightmicroscopeexamination,andlymphocytesubsetsbyflowcytometry.Results:IC50ofDDP,ADM,totalpolysaccharides,andadenosineongrowthinhibitionofhumanlungadenocarcinoma(PAA-1)cellwere9.05μg/mL,36.21μg/mL,1086mg/mLand7.81mg/mL.ItisantagonistofPolysaccharidecombinedwithADMorDDPongrowthinhibitionofPAA-1cells.Adenosinewith8mg/mLcombinedwithADMwith4μg/mLindicatesynergism.ItisnodifferentbetweendifferentconcentrationsofadenosinealoneandcombinedwithDDPoncellgrowth.Withtheincreaseofconcentrationofadenosine,G0/G1phasecellsdecreased,whiletheG2/MphaserelativeincreasewhenadenosinecombinedandADM.Itisnodifferentbetweenpolysaccharidegroupandnegativecontrolgrouponcolony-formingrateofPAA-1cellinvitro.Adenosinegroupswereslightlylowerthannegativecontrolgrouponcolony-formingrate.Withagradualincreaseintheconcentrationofadenosine,therateofcolony-forminggraduallydecreased.PolysaccharideshadnoeffectononlymphocytesubsetsofPAA-1cellinvitro.Conclusion:Thepolysaccharidesandadenosinehasacertainanti-tumoreffectsinvitro.PolysaccharidecombinedwithADMorDDPcannotincreasetheiranti-tumoreffectsinvitro,adenosinecombinedwithADMcanincreaseanti-tumoreffectsinvitro.
Keywords:Cordycepscicadae;totalpolysaccharides;adenosine;tumor;invitro
收稿日期:2009-11-10
基金项目:浙江省中医药管理局资助项目(2007CB186)
作者简介:蔡菊芬(1953-),女,浙江萧山人,主任医师,研究方向:肿瘤化疗及中西医结合诊治。
蝉花是一传统名贵中药,含有多种必须氨基酸、真菌多糖、腺苷、生物碱、麦角甾醇、虫草素酸等成分,具有滋补强壮,抗疲劳抗应激以及免疫调节作用等。笔者前期工作已经从蝉花中提取了总多糖和腺苷,笔者进一步研究了其在体外的抗肿瘤作用。
1仪器与材料
1.1仪器
[BW(S(Z,1,2)MD2]
[WT5”FZ〗中华中医药学刊
TU-1800PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。高效液相色谱仪ShimadzuLC-20AT型、SPD-20A(VWD检测器),N2000工作站。CO2培养箱(德国Heraeus公司),流式细胞仪(型号FACSCalibur,美国BD)。荧光倒置显微镜(Olympus)等。
1.2材料
腺苷、虫草素对照品:由中国药品与生物制品检定所提供。CycleTest细胞周期试剂盒(美国BD公司),RPMI1640培养液(美国GIBCO),小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),(简称DDP,云南个旧生物制药有限公司产品,批号:070101),阿霉素(简称ADM,浙江海正药业股份有限公司,批号071105),总多糖和总腺苷(由浙江省医学科学院药物研究所天然药物研究室提供,苯酚硫酸法检测,未减去水分含量的蝉花中总多糖含量为51.6%,蝉花总多糖中的水分含量为8.7%。蝉花中腺苷在210nm检测时,纯度为19.88%;在260nm检测时,纯度为31.82%。),CD25,CD19,CD3,CD4,CD8,CD56,CD44抗体(美国BD)淋巴细胞分离液,PBS缓冲液,RPMI1640培养液(美国GIBCO)等,
1.3细胞株
人细胞肺癌细胞系PAA-1。
2方法
MTT法检测DDP、ADM、总多糖、总腺苷单独及联合用药对人肺腺癌(PAA-1)细胞的生长抑制能力。
2.1实验分组
DDP采用浓度为0.3125μg/mL,0625μg/mL,1.25μg/mL,2.5μg/mL,5.0μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL和160μg/mL;ADM采用浓度为0.25μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL,2.0μg/mL,4.0μg/mL,8.0μg/mL,16μg/mL和32μg/mL;总多糖采用浓度为:0.3125mg/mL,0.625mg/mL,1.25mg/mL,2.5mg/mL,50mg/mL和10.0mg/mL;腺苷采用浓度为:0.0625mg/mL,0125mg/mL,0.25mg/mL,0.5mg/mL,1.0mg/mL,2.0mg/mL,4.0mg/mL,80mg/mL,16mg/mL和32mg/mL;DDP与多糖联合作用,分别为:阴性对照组,DDP16.0μg/mL,DDP8.0μg/mL,DDP40μg/mL,DDP2.0μg/mL,DDP16.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP8.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP4.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP2.0μg/mL+多糖5mg/mL;DDP与多糖联合作用,分别为:阴性对照组、ADM16.0μg/mL、ADM8.0μg/mL、ADM4.0μg/mL、ADM2.0μg/mL、ADM16.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM8.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM4.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM2.0μg/mL+多糖5mg/mL;DDP与腺苷联合作用,分别为:阴性组、DDP8.0μg/mL、腺苷8mg/mL、腺苷05mg/mL、腺苷0.25mg/mL、DDP8.0μg/mL+腺苷8mg/mL、DDP8.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL、DDP8.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL;ADM与腺苷联合作用,分别为:阴性组,ADM40μg/mL、腺苷8mg/mL、腺苷0.5mg/mL、腺苷0.25mg/mL、ADM4.0μg/mL+腺苷8mg/mL、ADM4.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL、ADM4.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL。
2.2细胞实验处理
对数生长期PAA-1细胞用025%胰酶+0.02%EDTA消化后悬液配成7×105/mL,96孔板每孔加100μL,每孔7000细胞,培养24h后加药处理。每个处理组设6复孔。阴性对照组加100μL培养液;依照各实验分组加不同浓度药物,各孔终体积为200μL;处理24h后加20μLMTT,37℃5%CO2培养4h后离心,小心弃去上清,加150μL二甲基亚砜,微振荡1min使之充分溶解,酶标仪双波长(570nm/690nm)检测吸光度OD值。
2.3数据处理
对各组OD值取平均值,计算抑制率(IR)。药物抑制率=(1-药敏组平均OD值/阴性组平均OD值)×100%。对结果应用直线回归法分析IC50,并作相关性分析求r值。
2.4对体外培养细胞系细胞周期的影响
细胞分成15组,分别为:阴性组,腺苷8.0mg/mL组,腺苷0.5mg/mL组,腺苷0.25mg/mL组,DDP8.0μg/mL组,DDP8.0μg/mL+腺苷8mg/mL组,DDP8.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL组,DDP8.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL组,ADM4μg/mL组,ADM4μg/mL+腺苷8mg/mL组,ADM4μg/mL+腺苷0.5mg/mL组,ADM4μg/mL+腺苷025mg/mL组,多糖5mg/mL组,DDP8.0μg/mL+多糖5mg/mL组,ADM4μg/mL+多糖5mg/mL组。
PAA-1细胞按照1∶3传代,24h后加药换液,继续培养24h,0.25%胰酶+0.02%EDTA消化收集,PBS漂洗,离心,收集细胞沉淀75%冷酒精固定,按照CycloneDNA试剂盒说明书操作,BDFACSCalibur流式细胞仪检测并分析细胞周期。
2.5对体外培养PAA-1细胞系集落形成率的影响
2.5.1实验分组阴性组,多糖5mg/mL组,DDP8.0μg/mL组,ADM4μg/mL组,腺苷0.5μg/mL组,DDP8.0μg/mL+多糖5mg/mL组,DDP8.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL组,ADM4μg/mL+多糖5mg/mL组,ADM4μg/mL+腺苷0.5mg/mL组。
2.5.2实验方法对数生长期PAA-1细胞胰酶消化后培养24h,每组1瓶细胞分别处理24h,胰酶消化计数细胞,每组3瓶,每个培养瓶中加入400个细胞,加足量培养液,静止培养10天。然后倒去上清液,PBS小心漂洗2次,甲醇∶冰醋酸3∶1固定10min,PBS漂洗2次,加2%Giemsa染色10min,PBS漂洗2次,阴干后光镜检查,大于30个细胞的团块记为一个集落。
2.6对体外培养淋巴细胞亚群分化的影响
2.6.1实验分组阴性组,多糖5mg/mL组。
2.6.2实验方法无菌抽取人外周血100mL,加肝素抗凝,使肝素的终浓度为25IU,轻轻摇晃5min,使其抗凝完全。50mL离心管中加35mL淋巴细胞分离液,小心在上层加15mL抗凝血,2000r/min离心30min。小心吸取中间层淋巴细胞,PBS漂洗2次,1500r/min离心10min,收集沉淀细胞,计数,取3000万总细胞,加含有重组人白细胞介素-4(rhIL-4)10ng/mL,重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1000IU/mL的培养液10mL,37℃5%CO2培养3h。轻轻倾斜液面,使悬浮细胞漂浮,小心吸取,37℃5%CO2培养过夜。按照分组,加药培养24h,离心收集细胞,PBS漂洗2次,分5小管,4管分别加CD25/CD19,CD4/CD8,CD56/CD3,CD44抗体10μL,5号管作为阴性对照不加抗体,避光孵育30min,流式细胞仪检测。
3结果
3.1MTT法检测DDPADM总多糖总腺苷对PAA-1细胞的生长抑制能力
见表1。
表1DDPADM总多糖总腺苷对PAA-1细胞的生长抑制情况
组别IC50r
DDP9.05μg/mL0
ADM36.21μg/mL20.66
总多糖10.86mg/mL54.52*
总腺苷7.81mg/mL39.51**
3.2各药联合对细胞生长的影响
3.2.1多糖和顺铂联合对PAA-1细胞的生长抑制作用5mg/mL多糖联合16μg/mL,8.0μg/mL,4.0μg/mL顺铂作用时,对PAA-1细胞也有一定的抑制作用,但是与16μg/mL,8.0μg/mL,4.0μg/mL顺铂单独作用的效果分别相比,抑制率均降低,差异有统计学意义(P=0.000188,639E-06,0.000526);而5mg/mL多糖联合2μg/mL顺铂与2μg/mL顺铂单独作用相比,两者抑制率无显著差异(P=0.099>0.05)。总之,5mg/mL多糖和顺铂表现出强烈的拮抗效应,见表2。
表2顺铂及顺铂联合多糖对PAA-1
细胞生长抑制作用(±s)
组别OD值平均抑制率(%)
阴性对照组0.9745±0.09860.00
DDP16.0μg/mL0.4432±0.052354.52*
DDP16.0μg/mL+多糖5mg/mL0.6798±0.086430.24*
DDP8.0μg/mL0.5895±0.058639.51**
DDP8.0μg/mL+多糖5mg/mL0.8277±0.034615.07**
DDP4.0μg/mL0.7652±0.042421.48***
DDP4.0μg/mL+多糖5mg/mL0.8802±0.04439.68***
DDP2.0μg/mL0.8464±0.039613.15
DDP2.0μg/mL+多糖5mg/mL0.9015±0.07567.49
3.2.2阿霉素联合多糖对PAA-1细胞生长抑制作用与16μg/mL阿霉素单独作用相比,5mg/mL多糖与阿霉素联合作用时,对细胞的生长抑制率降低,差异有统计学意义(P=0.0308),而与8.0μg/mL、4.0μg/mL、2.0μg/mL阿霉素联合作用时,对应各组的抑制率没有显著性差异(P=0909,0.987,0.891)。总之,5mg/mL多糖与阿霉素表现出拮抗效应,见表3。
3.2.3顺铂联合腺苷对PAA-1细胞生长抑制作用与8.0μg/mLDDP单独作用相比,8mg/mL、0.5mg/mL、025mg/mL浓度腺苷与其联合作用时,对细胞生长抑制作用均无显著差异。因此,腺苷和DDP表现出拮抗效应,见表4。
表3阿霉素及阿霉素联合多糖
对PAA-1细胞生长的影响(±s)
注:阿霉素16.0μg/mL+多糖5mg/mL与16μg/mL阿霉素单独作用相比,*P=0.0308
表4顺铂联合腺苷对PAA-1细胞生长抑制作用(±s)
组别OD值平均抑制率(%)
3.2.4阿霉素联合腺苷对PAA-1细胞生长抑制作用8mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL浓度腺苷与4.0μg/mL阿霉素联合作用和4.0μg/mL阿霉素单独作用相比,对细胞生长抑制作用均显著增加,差异具有统计学意义(P=230524E-08,0000116,9.8488E-05)。数据显示,0.5mg/mL、0.25mg/mL腺苷与4μg/mL阿霉素联合作用时,显示出拮抗效应;而当8mg/mL腺苷与4μg/mL阿霉素联合时,对细胞显示协同效应,见表5。
表5阿霉素联合腺苷对PAA-1细胞生长抑制作用(±s)
组别OD值平均抑制率(%)
注:与4.0μg/mL单药阿霉素作用相比,*P2.30524E-08,**P=0000116,***P=9.8488E-05。
3.3对体外培养细胞系细胞周期的影响
单DDP组,各浓度腺苷组,DDP和腺苷联合组,多糖组,多糖和DDP,多糖和ADM组中,细胞各周期并未出现明显变化。ADM组,ADM和腺苷联合组的G0/G1期细胞明显减少,特别是单用ADM组,G0/G1细胞特别少,而G2/M期细胞特别增多。ADM和腺苷联合作用,随着腺苷浓度的增加,G0/G1期细胞逐渐减少,而G2/M期相对增加,见表6。
表6各组处理对体外培养细胞系细胞周期的影响
3.4对体外培养PAA-1细胞系集落形成率的影响
加化疗药各组,及联合使用各组的集落形成率远低于阴性对照组,而多糖组的形成率和阴性对照组未见明显差异。不同浓度腺苷组的集落形成率略低于阴性对照组,随着腺苷浓度逐渐增加,集落形成率逐渐下降,见表7。
表7各组处理对体外培养细胞集落形成率的影响(±s)
组别集落数P值
3.5对体外培养淋巴细胞亚群分化的影响
多糖5.0mg/mL体外处理淋巴细胞24h后,各组加抗体孵育后,流式测分型。经多糖处理和阴性对照组两者之间未看到明显差别,见表8。
表8多糖处理对体外培养淋巴细胞亚群分化的影响
组别阴性对照组(%)多糖5.0μg/mL(%)P值
4讨论
蝉花是麦角菌科真菌大蝉草(CordycepscicadaeShing)寄生于蝉科昆虫山蝉(CicadaflammataDist)若虫上的子座及若虫尸体的干燥复合体。蝉花药用已经有1000多年时间,含有多种必须氨基酸、真菌多糖、腺苷、生物碱、麦角甾醇、虫草素酸等成分,具有滋补强壮,抗疲劳抗应激以及免疫调节作用,所含的虫草多糖具有抗肿瘤作用[1]。与冬虫夏草相比,两者的菌株均为蝉拟青霉[Paccilomyccscicadac(Miqucl.)Samson],含有相近的成分,因此蝉花常被用作冬虫夏草的代用品[2]。目前在市场上流通的蝉花药材基本上为无性型的蝉拟青霉药材。
化疗是治疗肺癌的主要手段之一。但是化疗药物都有较强的毒副作用,并且治疗中癌细胞容易产生耐药性。为了增加肿瘤细胞对化疗的敏感性,降低药物的毒副作用,许多医生在应用化疗药物的同时给病人进行中医中药扶正治疗。多年的研究观察表明,化疗同时配合中医中药辨证治疗,能减轻化疗的毒副反应,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高机体对化疗的耐受性,尤其在延长中位生存期和生存率方面有良好的疗效。
蝉花作为一味名贵中药,在临床上多用于镇痛,镇静,提高机体的免疫能力,改善病人的营养状况,实践中也有将蝉花应用于中药抗肿瘤[2],但是蝉花的直接杀伤肿瘤作用有待开发。
蝉拟青霉中主要的活性成分包括虫草多糖、腺苷以及虫草素。本项研究表明蝉拟青霉中多糖和腺苷成份含量较多,但是未提取到虫草素。多糖和腺苷在一定的浓度下对癌细胞的生长有明显的抑制作用,且存在剂量关系,随着作用时间的不断增加,但是两者的使用量都较大,在临床上较难应用于直接杀伤。
多糖和DDP和ADM联合应用未见有明显的抑制效率提高,反而使同浓度下DDP和ADM的杀伤降低。这和我们前期的研究一致[3]。这表明多糖对直接杀伤肿瘤细胞这方面没有协同增效作用。多糖单独使用和DDP、ADM联合使用与阴性对照相比,细胞的周期分布未见明显变化,但是和单独使用ADM相比,细胞G0/G1期变化较大。这和我们前期工作有一定的分歧,可能的原因是粗提物和纯总多糖相比,含有一定量的未知物质,今后将对这部分物质继续进行分离鉴定。
单独使用多糖对集落形成率有一定的影响。但是多糖联合化疗药物和单独使用化疗药物两者之间未见有明显差异。
腺苷在0.25mg/mL～8mg/mL浓度,对细胞的抑制率保持大约35%,出现此平台效应。在和DDP联合时,显示出明显的拮抗作用。而当联合ADM时,ADM4.0μg/mL+腺苷8mg/mL对细胞出现协同杀伤作用,ADM4.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL、ADM4.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL时,腺苷出现拮抗作用,表明腺苷在这个浓度范围内,对细胞的作用可能存有2种不同的机制,单用低浓度腺苷时,抑制效应占主要,但是遇上ADM时能起到拮抗ADM的作用。单用较高浓度腺苷时,促进细胞生长的机制逐渐加强,但是和ADM联合时显示出协同作用。此现象尚未见文献报道。具体的作用机制有待更深入研究。
腺苷联合ADM时,能使细胞周期向对照组比例转化,削弱ADM的改变周期效应,随腺苷浓度降低,这个削弱效应越明显。这与低浓度腺苷和ADM有拮抗效应相吻合。
多糖对体外培养的淋巴细胞亚群分化没有明显效果。而文献中,在大鼠身上使用的多糖能显著影响机体的免疫能力,这表明多糖对免疫能力的促进功能依赖整个机体来发挥作用,或者是多糖对免疫能力的影响主要作用于淋巴细胞以外的其他免疫相关细胞群。
实验表明,蝉拟青霉总多糖和总腺苷有一定抗肿瘤的能力,能够在体外发挥明显的抑瘤作用,有进一步研究和开发的必要。但是总多糖和总腺苷的各自作用机制有所不同,高浓度和低浓度的腺苷作用也不尽相似,需要有进一步实验研究来指导临床应用。
参考文献
[1]史宇翔.冬虫夏草药理作用研究概况[J].中国药业,2005,14(2):72-74.
[2]秦葵,陈红英.蝉花的研究概况[J].基层中药杂志,2002,16(6):54-55.
单细胞生物总结篇3
作者：何建军，任予，霍永平，张云锋，王珂，陈武科
【关键词】西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科，陕西西安710061
【Abstract】AIM:ToanalyzedynamicallythechangesofCD8+Tcellsanddendriticcells(DC)insentinellymphnode(SLN)inbreastcancer.METHODS:Atotalof82SLN，from31breastcancerpatientsundergoingtheSLNbiopsyfromApril2001toJune2003，wereexaminedinthestudy.Ofthe31patients，12hadmicrometastasisinSLNobservedthroughthedetectionofCK19mAb，9wereprovedofnonmetastasisinSLNandtheother10hadmetastasisfoundbyHEstaining.WithSABCimmunohistochemistryforCD8mAbandS100polyclonalantibody，wegottheratiosofpositivecellnumberstototallymphocytenumberin5highpowerfieldsandcountedtheiraverage.RESULTS:Amongthe82SLN，nonmetastasiswasfoundin35SLN，micrometastasisin20SLN，andmetastasisin27.TheaverageratiosofCD8+TcellsandS100+DCtototallymphocyteweredifferentsignificantlyamongthe3groups(P
【Keywords】breastneoplasms;sentinellymphnodes(SLN);CD8positiveTlymphocytes;dendriticcells
【摘要】目的：分析乳腺癌SLN中CD8+T细胞及DC的变化规律.方法：自200104/200306所进行的乳腺癌SLN活检病例中，选择应用CK19mAb检测到SLN具有微转移的患者12例，并随机选择无转移的9例，HE有转移的10例共82个SLN.将82个SLN分为无转移、微转移及转移组；选择CD8单抗及S100多抗，采用免疫组化SABC，计数5个高倍视野下阳性染色细胞数和淋巴细胞总数的比值，取其平均值，得出阳性细胞百分比率.结果：82个SLN中未转移35个，微转移20个，转移27个；三组淋巴结中CD8+T细胞和S100+DC占总淋巴细胞的比率有统计学差异（P
【关键词】乳腺肿瘤；前哨淋巴结；CD8阳性T淋巴细胞；树突细胞
0前言
Alessandro［1］认为肿瘤区域引流淋巴结是抗肿瘤免疫反应产生的初始和主要部位，在其中可出现一系列的肿瘤免疫反应.前哨淋巴结（SLN）是区域淋巴引流的第一位点，从肿瘤组织引流的物质可能首先到达SLN中.我们采用免疫组化的方法，观察乳腺癌SLN中在无转移、微转移及转移状态下CD8+T细胞及S100+DC的动态变化规律.
1对象和方法
1.1对象200104/200306，采用前哨淋巴结活检方法［2］，选择应用CK19mAb（武汉博士德公司）检测到具有微转移的患者12例，并随机选择无转移的9例，HE有转移的10例共82个SLN，再次应用常规病理及CK19mAb检测微转移.将82个SLN分为无转移、微转移及转移组；所有的患者术前均未接受化疗或放疗.鼠抗人人CD8mAb和鼠抗人S100多抗（NovocastraLaboratoriesLtd，UK）.
1.2方法采用免疫组化SABC法，每批实验均设阴性对照（PBS液替代一抗）和阳性对照（人扁桃体组织）.染色过程：脱蜡水化、抗原修复、封酶、每张切片滴加50μL左右一抗（CK19mAb1∶100倍稀释、CD8mAb及S100多抗1∶50倍稀释），37℃孵育90min，PBS冲洗，5min×3次；每张切片滴加50μL左右的生物素标记的二抗（兔抗鼠的IgG），37℃孵育30min，PBS冲洗，5min×3次；然后滴加链霉卵白素生物素复合物，37℃孵育20min；再加50μL左右的增强剂，37℃浸泡20min，PBS冲洗，5min×3次；再滴加链霉卵白素辣根过氧化物酶，37℃孵育20min，PBS冲洗，5min×3次；然后每张切片滴加新配制的DAB显色液，镜下观察控制显色反应；苏木素复染核6min，自来水冲洗，中性树胶封片.观察标准：①选择免疫组化染色阳性细胞密集区域，取5个高倍视野（×400），以目镜测微网计数阳性染色细胞数和淋巴细胞总数，取其平均值，得出阳性细胞占总淋巴细胞数的百分比率.②微转移的判断标准：HE未发现转移，应用CK19mAb行免疫组化，在SLN中发现单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团直径小于2mm的转移灶.
统计学处理：不同转移状态下SLN的阳性细胞用平均比率x±s表示.所有数据均经SPSS10.0统计软件包处理，包括方差齐性分析（显著性水准双侧α=0.05），t检验（显著性水准双侧α=0.01），单因素方差分析（显著性水准双侧α=0.01）.
2结果
本实验82个乳腺癌SLN，无转移35个，微转移20个，转移淋巴结27个.
2.1CD8+T细胞在SLN中的表达CD8主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内有少许表达（图1）.经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒.无转移、微转移及转移SLN中CD8+T细胞占总淋巴细胞的比率分别为8.2±1.6，5.3±1.6和4.7±2.3，单因素方差分析显示三组存在统计学差异（F=31.406，P
A：未转移；B：微转移；C：转移.
图1CD8+T细胞在乳腺癌SLN中的表达×400（略）
2.2S100+细胞在SLN中的表达S100+主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内亦有表达；经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒（图2）.无转移、微转移及转移SLN中S100+细胞占总淋巴细胞的比率分别为4.1±1.6，3.5±1.7和2.5±1.1；三组存在统计学差异（F=9.171，P
A：未转移；B：微转移；C：转移.
图2S100+细胞在乳腺癌SLN中的表达×400（略）
3讨论
CD8+T细胞是一种细胞毒T细胞，主要产生特异性细胞免疫.在肿瘤引流淋巴结的肿瘤免疫研究中，CD8+T细胞也是一个主要研究的免疫细胞.Lores等［3］通过T淋巴细胞的多种膜标志包括CD8+T细胞来研究肿瘤引流淋巴结中的肿瘤免疫，发现在引流淋巴结中肿瘤转移出现的早期呈现强烈的免疫反应，但不久就下调了.这一结果在本实验中得到验证，CD8+T细胞占总淋巴细胞数的比率在无转移组与微转移组间有明显差异，而微转移组与转移组间未显示差异.王水等［4］采用流式细胞技术比较乳腺癌SLN与非SLN中免疫功能，发现肿瘤未转移时，SLN的CD8+T细胞数量与非SLN差异无显著性；而当肿瘤转移时，SLN和非SLN的T细胞的比例发生显著性改变，由正常的以CD4+T细胞为主，转变为以CD8+T细胞为主.该结果似乎与本研究结果相反，考虑除与不同研究方法以及样本量偏小有关外，本研究结果显示无转移、微转移及转移的SLN中，CD8+T细胞占总淋巴细胞的比率呈现递减趋势，而非比较的SLN中的CD8+T细胞数量，以后研究中SLN淋巴细胞群谱的描绘将有助于解释这两个研究结果的不同.
IDCs位于淋巴组织T细胞区，由LC移行至淋巴结而来，高表达MHCⅠ，MHCⅡ类分子和S100蛋白，具有较强的免疫激活作用.DC在成熟过程中，同时发生迁移，由外周组织通过淋巴管和（或）血液进入次级淋巴器官，然后激发T细胞应答.Sakakura等［5］认为区域淋巴结中树突细胞密度、数量的变化反映了机体抗肿瘤能力的变化，树突细胞减少是机体全身或局部淋巴结中免疫力下降所致.因此，局部淋巴结中DC的密度、数量可能更好地反映机体抗肿瘤免疫力.Huang等［6］应用免疫组化的方法研究乳腺癌SLN和非SLN中S100+DC的变化规律，发现SLN中DC的密度以及DC的计数明显低于非SLN中，从而认为是肿瘤导致DC的数量减少.本研究显示在SLN处于微转移状态时S100+DC的数量与无转移状态时无明显的差异，但当SLN出现明显转移时，S100+DC的数量则明显减少，具有统计学意义.说明微转移状态对DC数量的影响不明显，而一旦出现明显转移，则可明显使DC的数量减少，从而使细胞免疫受到抑制.
从上述两种细胞数量的改变，我们发现，随着SLN中肿瘤转移的逐渐出现，细胞免疫逐渐受到抑制，呈现一个动态的变化过程.我们计划从分子生物学的水平来进一步研究SLN中免疫细胞的功能改变，以从肿瘤引流淋巴结的角度更加深入的认识肿瘤免疫抑制的机制.
【参考文献】
［1］AlessandroDS.Lymphnodemetastasestheimportanceofthemicroenvironment［J］.Cancer，2000，88(1):175-180.
［2］何建军，任予，陈武科，等.专利蓝与99mTC硫化锑胶体联合鉴别乳腺癌SLN［J］.中国现代医学杂志，2004，14（20）：39-40.
［3］LoresB，GarciaEstevezJM，AriasC.Lymphnodesandhumantumors［J］.IntJMolMed，1998，1(4):729-733.
［4］王水，范萍，武正炎.乳腺癌前哨淋巴结淋巴细胞亚群的初步研究［J］.中华肿瘤杂志，2004，26(4):220-222.
单细胞生物总结篇4
1资料与方法
1.1一般资料收集本院2010年9月1日至2010年12月31日送检至微生物室进行培养且分离出革兰氏阴性菌菌株的病例共计403例。标本包括呼吸道分泌物、脑脊液、胸水、腹水、血液、尿液、粪便、脓汁及引流液等。其中呼吸道分泌物264例，其他为139例。同一患者多次重复培养且分离出相同菌株者以首次分离出的菌株计数。其中多数为单菌株，少数为复合菌株，总计分离出429株菌株，铜绿假单胞菌菌株116例，占27.2%，其次依次为肺炎克雷白杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肠阴沟杆菌。116例铜绿假单胞菌菌株标本中80例来源于呼吸道分泌物，占呼吸道总标本数的30.7%，20例来源于其他，占其他标本总数的14.4%。其中呼吸道分泌物组平均年龄69.2岁，其他标本组的平均年龄为53.1岁。
1.2方法采用哥伦比亚血琼脂平板、巧克力色平板、中国蓝平板、M-H平板进行细菌培养，由法国梅里埃VITEK-32型微生物全自动鉴别仪进行分离菌株鉴定。
2结果
2.1从资料中可以看出，铜绿假单胞菌在医院感染中占革兰氏阴性菌感染的首位，比例达27.0%，远远高于卫生部公布的2006~2007年度全国细菌耐药监测网数据所显示的铜绿假单胞菌检出率占革兰氏阴性菌感染的18.3%，说明了近年铜绿假单胞菌感染人群在逐年递增，其缘于细菌对抗生素的耐药性逐渐上升［2］。
2.2从资料还可以看出，共分离出116例铜绿假单胞菌菌株，送检呼吸道分泌物标本264例检出铜绿假单胞菌菌株比例为30.7%，而139例其他标本中检出铜绿假单胞菌菌株比例为14.4%，说明呼吸系统容易合并铜绿假单胞菌感染。从年龄分布上看，呼吸道分泌物标本组中老年人居多，平均年龄达69.2岁，而其他标本组中非老年人群居多，平均年龄为53.1岁。说明铜绿假单胞菌多侵袭老年患者。
3讨论
3.1铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，是一种非发酵的革兰氏阴性杆菌，为专性需氧菌，在自然界中广泛分布，为土壤中存在的常见细菌之一。正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会及耳道、呼吸道和肠道内均可存在，具有低致病性、低检出率。其对外界抵抗力较强，对紫外线不敏感而不易被灭活。医院内的多种管路、设备及器械上均曾分离到本菌，可以通过各种途径传播给患者，包括操作、患者与患者、患者与医护人员之间的传播。所以铜绿假单胞菌多侵袭患血液系统疾、恶性肿瘤、大面积烧伤、各种术后插管、合并多种慢性疾病尤其呼吸系统疾病和免疫缺陷的患者患者，可以明确存在细菌选择低免疫力宿主的因素。该病历中送检呼吸道分泌物标本的病例多为高龄且具有肺气肿、支气管扩张、陈旧性结核等肺病，还有部分为肺部肿瘤或脑卒中、心衰合并肺内感染的患者，其呼吸道及全身免疫力低下，致使患者的抗病力及机体的自我修复力明显减弱，细菌得以入侵引起局部或全身感染。宿主免疫力低下为出现条件致病感染的一个重要原因。
3.2细菌耐药包括染色体介导的耐药和获得性耐药。染色体介导的耐药源于该细菌本身的耐药基因即存在其染色体上，其具有典型的种族特征，能够世代相传，耐药性稳定且与药物的接触无关。而获得性耐药多为细菌的质粒、转座子后天获得耐药基因所致。质粒是位于染色体外的具有复制能力的一种环状DNA，其编码的基因功能可以使细菌表现出耐药性，而且质粒可以在不同的细菌间穿梭并将该基因带入其他细菌，从而扩大细菌的耐药性。转座子又称跳跃基因，为比质粒更小的DN段，其可以在染色体中跳跃并将耐药基因片段插入到新的位点而引起细菌耐药。无染色体、质粒或转座子介导的耐药性，一般只发生在少数细菌中，其危害性不大，但当敏感菌被大量消灭后，耐药菌才在一定条件下大量繁殖而成为各种感染的主导者。
3.3铜绿假单胞菌存在以下5种耐药机制［3］①主动外排机制：因其外膜存在独特的药物泵出系统，可以将进入细胞内的药物泵出细胞外而导致细菌耐药，这一系统称为外输泵，其可能是细菌在进化过程中形成的一种细胞自身解毒系统。当细胞内的药物浓度聚集到一定程度，药物外输系统相关mRNA的表达增加，结果使细胞外膜上的外输泵数量增加，使细胞内的药物被泵出，从而使菌体内的药物浓度降低而导致耐药出现。该机制在铜绿假单胞菌的多重耐药机制中起主要作用。②生物被膜机制：为细菌生长过程中为适应生存环境而吸附于活性固体表面时，其分泌胞外多聚物形成生物膜，生物膜具有极强的黏附性和耐药性，能够抵抗超过百倍的正常剂量的药物。据资料显示，细菌的遗传性耐药水平较高则形成生物膜的能力较弱，考虑耐药水平较高的细菌本身对药物就不敏感，所以药物不易诱导细菌形成生物膜；相反则诱导细菌形成生物膜从而增加抗药性，因此细菌生物被膜的形成来源于药物诱导［4］。③产生抗生素灭活或修饰酶机制：如产生灭活酶、钝化酶来灭活或修饰进入细菌内的抗生素从而使之失活。④改变抗生素作用靶位机制：靶位的改变包括其亲和力减低或替代性途径的出现，其通过诱导酶对菌体成分进行干预、修饰或通过基因突变造成靶位变异而引起抗生素失去作用位点。⑤外膜屏障机制：细菌通过细胞外膜通透性下降而阻碍抗生素进入细菌内膜的靶位以减少抗生素的吸收。亚胺培南对铜绿假单胞菌发生耐药即为此机制。因亚胺培南等药物需要穿透铜绿假单胞菌细胞膜上的微孔才能到达作用的靶位，当铜绿假单胞菌编码微孔蛋白的基因发生突变时，细胞膜上的微孔缺失，药物无法进入细胞内而失去作用。
3.4我们应用抗生素的目的是为了解除人类的病痛并延长人类生命，所以抗生素还需要长久应用。笔者建议应用中注意：①针对免疫力低下人群，为减少其细菌入侵机率，需要提高机体免疫力，不单纯注意冷暖、加强体育锻炼等，还要应用各种疫苗及增加免疫力的药物，并开发治疗感染的非抗生素类药物。②减少动植物抗生素应用及消毒剂的不合理使用，因其可以诱导并加重细菌耐药性。③减少不必要抗生素在人体的应用，包括使用广谱及超广谱抗生素及预防性用药，以减少细菌的选择性压力，从而减少细菌耐药的出现。希望通过我们的努力让抗生素发挥最大潜力，确确实实造福于人类。
参考文献
［1］ProjanS.J.New(andnottonew)antibacterialtargets-fromwhereandwhenwillthenoveldrugscome?Curr.OpinPharmacol,2002,2(5):513-522.
［2］景莉,范开华.铜绿假单胞菌医院感染38例细菌耐药率与抗菌药物应用分析.中日友好医院学报,2010,24(6):343-346.
［3］施凯舜,潘发愤.铜绿假单胞菌耐药研究进展.浙江医学,2008,30(2):199-201.
单细胞生物总结篇5
【关键词】流式细胞术
EffectofwildtypeandmutantDNApolymeraseβexpressiononCHOcellsgrowth
【Abstract】AIM:TostudytheeffectsoftheDNApolymeraseβ(DNApolβ)ofwildtypeandthemutant（58bpdeletion）onChinesehamsterovarycells(CHO).METHODS:TheexpressionofmRNAofwildtypeandthemutantintransfectantcellswasdeterminedbyRTPCRandthegrowthcurveoftransfectedCHOcellswasdrawnwiththeMTTassay.Thechangesincellcyclewereanalyzedbyflowcytometry.RESULTS:Celllinesstablyexpressingwildtypeandthemutationalpolβwereestablished.TheCHOcellstransfactedbythemutantgenewerehigherthanuntransfactedCHOcellsinthegrowthrateofCHOcellsandthepercentageofSphasecellsinvitro(P<0.05).Theeffectsofthewildtypeenzymeongrowthrateandcellcyclewerenotobserved（P>0.05）.CONCLUSION:ThewildtypeandthemutanthavedifferenteffectonCHOcells.
【Keywords】DNApolβ;transfection;CHOcells;RTPCR;flowcytometry
【摘要】目的：比较野生型和突变型（58bp缺失）DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响.方法：将表达人野生型和缺失型DNApolβ的中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），用RTPCR方法鉴定野生型和缺失型DNApolβmRNA水平的表达，MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期.结果：转染野生型和突变型DNApolβ的CHO细胞株中，都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型（58bp缺失）polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞，差异有统计学意义(P<0.05).而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响（P>0.05）.结论：高表达外源性野生型和突变型DNApolβ，对CHO细胞生长具有不同的影响.
【关键词】DNApolβ;转染;CHO细胞;RTPCR;流式细胞术
0引言
碱基切除修复（baseexcisionrepaire,BER）是清除细胞内DNA损伤的主要途径，DNA聚合酶β（DNApolymeraseβ，DNApolβ）是BER过程中的关键酶.研究polβ基因的突变及功能异常在肿瘤发生发展中的作用，对进一步阐明肿瘤的分子发病机制,对肿瘤的基因治疗有重要意义.我们将不同类型的polβ的真核表达载体转染哺乳动物细胞，观察野生型和突变型polβ基因的表达对细胞生物学特性的影响如下.
1材料和方法
1.1材料
中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycells,CHO)由陈萍萍博士惠赠,DMEM培养基为Hyclone公司产品,Trizol总RNA提取试剂盒为Gibco公司产品.CHO细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基、50mL/LCO2,37℃,饱和湿润空气中培养.
1.2方法
1.2.1表达产物的mRNA水平的鉴定按Trizol试剂盒操作说明，分别提取野生型和突变型polβ转染和空载体转染的CHO细胞及未转染CHO细胞总RNA.紫外分光光度计测定其浓度.逆转录反应体系总体积为30μL,反应体系中含1mmol/LdNTP,2.5μmol/L随机引物，166.7nkatRNA酶抑制剂，250.05nkatAMV逆转录酶，1×逆转录反应缓冲液积5mmol/LMgCl2,取总RNA2μg.逆转录反应条件为42℃60min,95℃变性5min.当鉴定目的基因在mRNA水平的表达时，RTPCR中我们采用了特异性较强的引物，利用质粒中T7启动子为特异性的上游引物序列，polβ特异引物为下游引物序列，来证实转染细胞中外源基因的存在.上游引物为5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′，下游引物为5′ACTCGTATCATCCTGCCGAA3′，野生型和突变型polβ扩增片断大小分别为312bp和254bp,而未转染CHO细胞及转染空质粒细胞无相应片断.PCR反应总体积为30μL,反应体系中含1.5mmol/LMgCl2,10×PCR缓冲液3μL,200μmol/LdNTP,上下游引物各0.25μmol/L,Taq酶8.335U,逆转录产物5μL.PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环后，72℃延伸7min.取两种转染细胞和转染空载体及未转染CHO细胞的RTPCR产物各5μL，与上样缓冲液混合后进行15g/L琼脂糖电泳.
1.2.2检测CHO的生长曲线和细胞周期取野生型polβ转染组对数生长期（CHOPW）细胞一瓶，消化、细胞计数.取96孔培养板，每孔接种2×103个细胞，补充培养液至200μL,按常规条件培养.共设5个复孔，共接种6块板.接种后，每24h取出一培养板，加MTT20μL/孔，继续培养4h.小心吸除孔中的培养液，加入酸化异丙醇200μL/孔，在水平摇床上振摇10min,至紫色颗粒完全溶解.在酶标仪上490nm处测每孔的A并求出平均值.连续测6d.以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘生长曲线.同法、同时接种缺失型polβ转染组（CHOPM）,空载体转染组细胞（CHOneor，neor基因是载体pcDNA3.1中的标记基因，具有氨基糖苷抗生素G418抗性）和未转染组CHO细胞，测A值、绘生长曲线.另取汇合度达80%~90%的细胞一瓶，常规消化制成单细胞悬液，PBS洗两遍，10g/L的多聚甲醛1mL固定5min.使用BD公司DNA试剂盒依照说明处理样品.加A液（胰蛋白酶）250μL/样品，轻混，室温放置10min.加B液（中和液，且含RNase）200μL/样品,轻混，室温放置10min.加C液（PI染料）200μL/样品,轻混，2~8℃，放置10min.上机前用300目尼龙网过滤样品.上机测试.每组实验至少进行5次，图像分析采用CellQuest软件.
统计学处理：采用SPSS10.0软件，组间A值比较采用双因素方差分析，各组细胞S期比例的比较采用单因素方差分析.P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1RTPCR产物鉴定将RTPCR产物与DNA标准参照物一同电泳，所得的扩增产物为单一、特异性产物.扩增片断为分别为312bp和254bp,与理论相符（Fig1）.
2.2DNApolβ转染细胞生长曲线转染空载体和野生型DNApolβ基因对CHO细胞生长影响不大(P>0.05,Fig2)，而突变型DNApolβ基因转染CHO细胞后，其生长速度明显加快(P<0.05).
2.3polβ基因转染对CHO细胞周期的影响转染突变型polβ（CHOPM）、转染野生型polβ（CHOPW）和未转染组（CHO）细胞S期比例分别为51.9±0.5，45.9±0.6，45.4±0.5.表明CHOPM组S期比例明显增高，与CHO相比差异有统计学意义（P<0.05）；而CHOPW组S期比例与CHO组细胞相比无统计学差异(P>0.05).
3讨论
人类polβ基因位于8p12p11，全长35kb,单拷贝基因，有14个外显子及13个内含子组成.polβ不具有核酸内切酶和外切酶活性，更没有3′5′校读活性，这使得它在DNA复制过程中保真度很低［1］.食管癌、乳腺癌、胃癌等都有DNApolβ基因突变［2,3］.我们在30例浸润型食管癌标本中观察到13例polβ发生变异(43.3%).其中7例癌组织中存在相同58bp(177到234位核苷酸)的基因片段缺失［2］.进一步研究表明，polβ的突变体，其BER功能明显降低或缺如，甚至干扰了野生型polβ的BER功能.我们检测了转染组和对照组的细胞周期，发现突变的polβ引起S期比例明显增高.而野生型polβ对细胞周期并无明显影响.
高表达突变的polβ可能影响到细胞周期G1/S调控点蛋白功能失调，进入S期细胞增多.Kirsten等［4］发现在polβ缺陷的细胞经烷化剂MMS处理后2~5h，S期比例增加；而在15~30h后，G2/M期明显增高.相反，在野生型细胞中，同样剂量的MMS对细胞周期的影响是非常小的.结果显示MMS引起DNA损伤（包括单链和双链DNA损伤），由于polβ的缺陷无法修复损伤，在早期引起细胞短暂性的停止在S期，在晚期细胞停滞在G2/M期.总之，polβ基因的突变和表达异常可能影响到染色体的稳定性和细胞增殖基因的失调或改变，在肿瘤的发生发展中起一定的作用.
【参考文献】
［1］OsheroffWP,JungHK,BeardWA,etal.ThefidelityofDNApolymeraseduringdistributiveandprocessiveDNAsynthesis［J］.BiolChem,1999;274:3642-3650.
［2］董子明，赵国强，赵勤，等.人食管癌中polβ基因突变的研究［J］．中华医学杂志，2002；82（13）：899-902.
DongZM,ZhaoGQ,ZhaoQ,etal.AstudyofDNApolymeraseβmutationinhumanesophagealcancer［J］.NatMedJChin,2002;82（13）：899-902.
单细胞生物总结篇6
【中图分类号】R282．71；R681【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2008）08－0049－03
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、容易发生骨折为特征的全身代谢性骨病。骨质疏松症是老年人的一种常见病，随着人类寿命的延长，社会老龄化进程的加快，骨质疏松症的发生率呈逐渐上升趋势，已严重危害着老年人的身体健康。近年来中医药在防治骨质疏松症方面取得较大进展，在中医药防治骨质疏松症的研究中，中药淫羊藿的应用研究受到高度重视。现将近年来淫羊藿防治骨质疏松症的研究现状作一综述。
1淫羊藿的传统功效及其有效成分药理作用
淫羊藿为小蘖科多年生草本植物淫羊藿或箭叶淫羊藿的全草，性温，味辛、甘，归肝、肾经，有补肾壮阳、祛风除湿之功效1。《本草求真》中记述：“盖因气味甘温，则能补火助阳，兼有辛香则冷可除而风可散耳。”《本草备要》中称淫羊藿能“补命门，益精气，坚筋骨，利小便”。现代药理研究表明，淫羊藿的主要有效成分为黄酮类化合物，此外尚含有多糖类化合物、生物碱、木脂素、亚麻酸、维生素E、挥发油、微量元素等。淫羊藿能改善心肌缺血、降血压、抑制血栓形成、促进造血功能、调节免疫、抗骨质疏松、抗衰老、抗肿瘤等作用2。
2淫羊藿用于防治骨质疏松症的理论依据
中医文献中虽无骨质疏松症的病名，但《黄帝内经》中早就有“骨枯”、“骨痿”等类似本病的记载，且认为骨枯、骨痿与肾虚有关。如《灵枢・经脉篇》云：“足少阴气绝则骨枯。”《素问・痿论篇》云：“肾主身之骨髓……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”又云：“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”近年来，许多学者对肾虚与骨密度或骨矿含量的关系进行了研究，阐明肾虚与骨密度或骨矿含量的降低显著相关3，4。这些研究结果与中医“肾主骨”理论是相吻合的，证实了肾虚是骨质疏松症的主要病机，因此近年来中医药防治骨质疏松症多从补肾入手。而淫羊藿甘温助阳，有补肾壮阳之功效，《本草纲目》称其有“益精气、强筋骨、补腰膝”作用，许多用于防治骨质疏松症的中药复方中都含有淫羊藿。
3临床研究
淫羊藿在防治骨质疏松症的中药复方中占很大比例，许多临床防治骨质疏松症的验方中都含有淫羊藿。笔者对近年来临床报道的防治骨质疏松症的有效方药进行了统计，筛选了有效方剂26首，其中有15首验方选用了淫羊藿，淫羊藿的使用频率仅次于熟地黄而位居第二位5。中药复方是多味中药协同作用的结果，其疗效不足以表明淫羊藿本身的抗骨质疏松的作用，为此有部分学者采用单味补肾中药淫羊藿煎服治疗骨质疏松症，取得了较好的临床效果。曾炎辉等6以单味中药淫羊藿煎服治疗绝经后骨质疏松症60例，并将其与性激素替代疗法进行对照，观察其对骨痛症状改善情况、骨代谢生化指标及松质骨密度的影响，证明淫羊藿能明显缓解骨痛症状、改善骨代谢生化指标、提高松质骨密度，有效率达93．3％，与性激素替代疗法有效率比较无显著性差异。赵丽娜7用单味中药淫羊藿煎服治疗绝经后骨质疏松症15例，将其与性激素替代疗法进行对照，结果显示，淫羊藿在缓解骨痛、改善骨密度等方面与性激素替代疗法无显著性差异。
4实验研究
近年来，用实验方法研究单味中药淫羊藿对骨质疏松症的防治作用备受重视，有学者分别采用维甲酸灌胃、去势、切断坐骨神经和股神经等方法制备骨质疏松症大鼠模型，从大鼠血清生化指标、尿生化指标、骨矿含量、骨密度、骨组织形态以及骨生物力学指标等方面证明了单味中药淫羊藿对大鼠骨质疏松的发生具有较好的防治作用8～12。
为进一步探讨淫羊藿防治骨质疏松症的作用机制，许多学者采用体外成骨细胞分离培养的方法，探讨淫羊藿对体外成骨细胞的作用成为淫羊藿防治骨质疏松症的实验研究重点。雪原等13采用淫羊藿苷皮下注射去卵巢大鼠，取股骨干分离培养成骨细胞，检测成骨细胞Smad4的mRNA含量，结果显示去卵巢大鼠注射淫羊藿苷后成骨细胞内Smad4mRNA的水平升高，这为淫羊藿苷刺激成骨细胞功能，减少去卵巢大鼠的骨丢失提供了细胞内信号传导的理论依据。刘亦恒等14采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞，分别加入不同浓度的淫羊藿总黄酮培养液，观察淫羊藿总黄酮对成骨细胞中骨保护素（OPG）和核因子κB受体激活因子配体（RANKL）mRNA的影响，结果显示淫羊藿总黄酮明显增强了OPGmRNA的表达，使VOPG／VRNAKL比值增大，由此推测淫羊藿总黄酮可能通过增加成骨细胞OPG的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收，达到治疗骨质疏松症的目的。李淑梅等15采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞，在培养液中分别加入不同浓度的淫羊藿甙，观察成骨细胞的增殖和分化功能，用RT－PCR法测定成骨细胞OsxmRNA的表达，结果显示淫羊藿甙可促进OsxmRNA的表达，从而促进骨形成。陈虹等16采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞，在培养液中分别加入不同浓度的淫羊藿甙，观察淫羊藿甙对成骨细胞分泌的IL－6、TGF－β1、TNF－αmRNA表达影响，结果表明淫羊藿甙治疗骨质疏松症的部分机理可能与抑制IL－6、TNF－αmRNA的表达和促进TGF－β1mRNA的表达有关。相对于淫羊藿对体外成骨细胞的作用研究而言，探讨淫羊藿对体外破骨细胞的影响相对较少。王婷等17分离淫羊藿中单体黄酮成分，观察其对体外培养的前破骨细胞株RAW264．7增殖的影响，结果显示黄酮类化合物对RAW264．7的生长是促进还是抑制依赖于其自身的化学结构以及作用浓度，淫羊藿可能是通过黄酮类化合物抑制前体破骨细胞的增殖，进而抑制前体破骨细胞分化形成破骨细胞而发挥抗骨质疏松作用的。
大量的体外实验研究证实了淫羊藿能够促进成骨细胞的增殖并抑制破骨细胞的活性，也有学者研究了淫羊藿在体内对成骨细胞及破骨细胞的调节。叶纯等18观察了TNF－α、TGF－β1在灌服淫羊藿水提液的去势大鼠椎骨中的表达，结果表明，淫羊藿能持续的下调去势大鼠骨髓组织中单核细胞表达TNF－α，同时诱导骨微环境中TGF－β1表达增加，进而抑制破骨样细胞的生成，有效的预防绝经后骨质疏松的发生。等19观察了淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨组织中Ι型胶原蛋白代谢及组织蛋白酶K表达的影响，结果淫羊藿总黄酮各剂量组骨组织Ι型胶原的表达升高，组织蛋白酶K的表达减少，由此推断，淫羊藿总黄酮可能是通过促进去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞Ι型胶原的分泌，同时下调破骨细胞组织蛋白酶K的表达而抑制骨基质中Ι型胶原的分解，从而提高大鼠骨密度。
许多实验已证实淫羊藿具有激素样作用，其主要有效物质为黄酮类化合物，淫羊藿总黄酮对成骨细胞具有直接的刺激作用，能促使其增殖成熟。而另一些实验研究结果则显示淫羊藿总黄酮本身并无此作用，但口服淫羊藿总黄酮后的含药血清则能影响成骨细胞。李东晓等20研究了淫羊藿总黄酮及其大鼠含药血清、去蛋白含药血清对体外培养鼠颅骨成骨细胞增殖及骨钙素（OC）、骨桥蛋白（OP）和I型胶原mRNA表达的影响，结果显示：淫羊藿总黄酮对细胞增殖无明显影响，且在终浓度为1mg／ml时产生抑制作用；含药血清在各实验浓度下均能显著促进成骨细胞增殖，且呈一定的剂量依赖关系；去蛋白血清与含药血清的作用相似但作用强度略低。由此推测淫羊藿治疗骨质疏松的直接物质基础可能并非淫羊藿总黄酮，而与其经口给予后吸收入血的淫羊藿总黄酮代谢产物及其诱生物有关。马慧萍等21将淫羊藿总黄酮和含淫羊藿总黄酮大鼠血清分别以不同浓度加入大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）培养液中，进行细胞增殖和成骨性分化的分析，结果表明：淫羊藿总黄酮直接加入培养液对MSCs增殖无明显影响，含药血清则强烈刺激细胞增殖，成倍增加碱性磷酸酶染色阳性的克隆数。淫羊藿总黄酮不影响MSCs的成骨性分化，但含药血清显著提高碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量和钙盐沉积量。由此推测，淫羊藿总黄酮活性代谢产物强烈刺激MSCs的增殖和成骨性分化，是淫羊藿总黄酮抗骨质疏松症的重要机制。
5结语
综上所述，目前淫羊藿防治骨质疏松症的临床和实验研究取得了较大的进展，从不同角度探讨了淫羊藿防治骨质疏松症的作用机制。但也存在一定的问题，较为突出的是很多临床研究多集中在含淫羊藿的复方上，单味中药淫羊藿防治骨质疏松症的临床研究相对较少，且样本数量太小，缺乏多中心大样本的临床研究，这导致了结果的说服力不强。
参考文献
［1］杨永良主编．中药学．第1版．武汉湖北科学技术出版社，1989；258～259．
［2］葛淑兰．淫羊藿及其有效成分的药理研究进展．中国药师．2005；8（6）：462～464．
［3］全国十三省市骨矿含量调查合作组．骨骼生长衰老规律和原发性骨质疏松症预诊的研究．中国骨质疏松杂志．1995；1（1）：1～7．
［4］赵玉堂，刘凯军，李金花等．骨矿含量与肾虚、肾主骨关系的研究．中国骨质疏松杂志．1996；2（3）：19～21．
［5］谭清武．骨质疏松症临床验方用药规律探析．中医研究．2004；17（3）：2～3．
［6］曾炎辉，张泽梅，林永城等．绝经后骨质疏松症患者骨代谢生化指标检测及淫羊藿作用初探．国际医药卫生导报．2005；11（6）：24～26．
［7］赵丽娜．淫羊藿防治骨质疏松临床效果评价．现代中西医结合杂志．2003；12（9）：922～923．
［8］马慧萍，贾正平，白孟海等．淫羊藿总黄酮对大鼠实验性骨质疏松生化学指标的影响．中国药理学通报．2003；19（2）：187～190．
［9］金丽，罗丽娜．游泳加中药淫羊藿综合疗法对去势大鼠骨代谢生化指标的作用．山东体育学院学报．2006；22（6）：53～55．
［10］鲍加荣，杨继文，李树峰等．淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响．卫生研究．2005；34（2）：191～193．
［11］吴晓梅，马学军，郭成吉．淫羊藿总黄酮对失神经大鼠血清骨代谢指标密度和骨密度的影响．曲阜师范大学学报．2006；32（3）：108～11．
［12］濮祖茂，李勇，李晶等．淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠股骨头作用的扫描电镜观察与图像分析．中国骨质疏松杂志．2005；11（2）：246～250．
［13］雪原，齐清会，王沛等．淫羊藿苷对OVX大鼠成骨细胞Smad4mRNA的作用．天津医药；2004；34（4）：256～258．
［14］刘亦恒，臧洪敏，张海英等．淫羊藿总黄酮对成骨细胞中OPG和RNAKLmRNA基因表达影响的实验研究．中药材．2005；28（12）：1076～1078．
［15］李淑梅，宋利格，张秀珍等．淫羊藿甙对大鼠成骨细胞功能及Osterix表达的影响．同济大学学报（医学版）．2005；26（6）：8～11．
［16］陈虹，张秀珍．淫羊藿甙对大鼠成骨细胞分泌细胞因子的影响．同济大学学报（医学版）．2005；26（2）：5～7．
［17］王婷，张大威，张金超等．淫羊藿黄酮的分离鉴定及其对前破骨细胞株增殖的影响．中草药．2006；37（10）：1458～1462．
［18］叶纯，苏进，王凡．淫羊藿影响去势大鼠椎骨微环境中TNF－α、TGF－β1表达的研究．中国临床解剖学杂志．2006；24（6）：687～690．
［19］，宋利格，张秀珍．淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨组织Ι型胶原代谢及组织蛋白酶K表达的影响．中华内分泌代谢杂志．2006；22（3）：213～217．
［20］李东晓，王岚，吴瑕等．淫羊藿总黄酮及其含药血清对成骨细胞增殖及其相关基因表达的影响．中药药理与临床．2006；22（5）：16～19．