单细胞动物的特征范例(3篇)
单细胞动物的特征范文篇1
【摘要】目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（epc）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点.方法：密度梯度离心法获得单个核细胞，用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.细胞在接种后每2h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，直到晚期克隆出现.同期培养人脐静脉内皮细胞（huvec）进行比较.流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白.体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能，胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能.结果：epc在培养21~28d出现，表现出典型的内皮细胞“铺路石”外貌.与huvec相比，epc表达高水平的cd36和kdr（epcvshuvec,p<0.01），但表达cd146，结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异.体外培养100d，epc和huvec分别传代46次和25次，只有epc能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构.结论：人外周血来源的epc虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点，但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征.
【关键词】血管生成；内皮细胞；祖细胞；生物学性状
0引言
内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,epcs）原始储存部位在骨髓，受缺血信号刺激后向外周血释放，募集到缺血部位参与血管新生.但另有研究却发现，epcs在肿瘤血管新生、受损血管内皮修复、或成年动物体内血管再生方面，所起作用很小或几乎不起作用［1-3］.我们研究首先确认外周血循环中是否存在有真正的epcs，然后将其与成熟内皮细胞进行完整生物学性状对比分析.
1材料和方法
1.1材料histopaque，1.077,fitc标记的植物凝集素（ulexeuropaeusagglutinin?1,uea?1）、纤连蛋白（fibronectin）、fitc标记的抗?vegf?2受体（kdr）、i型胶原均为sigma公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（egm?2mvsinglequots）和i型胶原酶为bectondickinson公司产品；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白（dii?ac?ldl）购自abdserotec公司；vwf一抗和fitc标记二抗均购自dako公司；pe?cd34，fitc?cd14，fitc?cd146，均为bd公司产品.健康志愿者11（男9，女2）例，年龄46.5±13.1岁，肘静脉取血每例50ml，肝素（20ku/l）抗凝.hanks1∶1稀释血液，加入histo?paque经密度梯度离心法获得单个核细胞（mononuclearcells,mnc）.用hanks洗涤mncs3次，重悬于egm?2，调整细胞计数2×109/l，接种于100mg/l纤连蛋白包被的24孔培养板中.另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30cm，pbs冲洗脐静脉腔，i型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min.收集消化液、离心、洗涤，egm?2调整细胞计数2×109/l，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,huvec）用于实验.
1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点，应用序列黏附法去除淋巴细胞的混杂.每例血样在分离出mnc并接种后每隔2h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入egm?2静止培养，4d后换液.此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验.
1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用pbs洗涤2次，2.5g/l胰酶/edta消化后制成细胞悬液，密度为1×109/l.每份细胞悬液取150μl×2分装2个试管，分别加入fiti?cd14，fitc?cd146，fitc?kdr，pe?cd34及同型对照mab各20μl，避光反应30min，pbs洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次.上机后收集20000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示.
1.2.2内皮细胞vwf的表达贴壁细胞生长至80%汇合时用1∶1甲醇/丙酮固定，vwf一抗及fitc标记的二抗均作1∶50稀释，严格按说明步骤进行.
1.2.3细胞增殖潜能的测定epc及原代huvec生长至亚汇合状态时分别消化，制成稀释的细胞悬液，密度均为2×107/l，传代接种于25ml培养瓶中.然后按此方法对这两种细胞分别持续传代，直至细胞衰老.每传代细胞1次，记数为1次群体倍增.以培养时间为横坐标，群体倍增次数为纵坐标，绘制细胞群体倍增曲线图.
1.2.4体外血管形成实验用冷藏的egm?2配置浓度为2g/l的i型胶原溶液，100g/l碳酸氢钠滴定溶液ph值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100μl，37℃放置30min使其成胶.分别将2~3代贴壁的epc和huvec制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况.
1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11wk，购自郑州大学实验动物中心.收集epcs和huvecs，制成浓度为2×109/l的细胞悬液.用1.5g/l的碳酸氢钠、25mol/lhepes,100ml/l胎牛血清、300ml/legm?2制备浓度为3g/l的胶原溶液.将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢sc细胞?胶原溶液1ml.将裸鼠置于饲养笼28℃条件下30~60min，触摸裸鼠移植部位皮丘呈胶冻感为移植成功，然后常规条件饲养.21~30d处死裸鼠，取出移植体行病理切片分析.
统计学处理：采用spss11.0统计软件进行分析.计量数据以x±s表示，两组均数间的比较采用t检验，以p<0.05为有统计学差异.
2结果
mnc接种后7~11d可见有簇状聚集的早期克隆出现，中间是圆形细胞，周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞（图1a）.持续培养至21~28d可观察到晚期克隆的出现，细胞均呈多角形或纺锤形，紧密贴壁，聚集向外生长（图1b）.至35~42d，可见细胞增殖、逐渐汇合成片，呈现内皮细胞典型的“铺路石”外貌（图1c,d）.huvec接种当时为圆形、悬浮，24h后细胞即伸展、贴壁，呈梭形或多角形（图2a），5~7d后贴壁细胞基本汇合成单层，外观与epc来源细胞相同（图2b,c）.
2.1epcs与huvecs表型特征对比huvec相比，epc表达高水平的干/祖细胞标记cd34和kdr（p<0.01，图3）.单核细胞特异抗原cd14在两组细胞表面仅有微量表达，而泛内皮细胞标记cd146在两组细胞均为高表达但无统计学差异.vwf鉴定两组细胞均阳性证实为内皮细胞起源.a：第7日形成早期克隆×40；b：第22日形成晚期克隆×40；c：第37日晚期克隆增殖汇合；d：晚期克隆再种植形成单层内皮细胞，呈典型铺路石样外观×100.
图1epc体外培养细胞形态
a：种植后24h伸展贴壁×40；b：6d后增殖汇合×40；c：第二代huvecs呈铺路石外观×100.
图2huvecs体外培养形态特点
2.2epcs及huvecs体外增殖潜能对比epc传代接种后经历1~2d潜伏适应期，然后增殖旺盛，每3~4d传代1次.在100d时间内，epc传代46次，曲线陡直上升（图4）.此后传代时间渐延长，曲线由水平转为下降趋势.huvec传代周期为5~7d，曲线缓慢平坦上升，表明细胞增殖潜能低于epc.在68d时间内、同等培养条件下huvec共传代21次，然后曲线迅速下降，提示细胞开始衰老.在相同的100d时间内，huvec总计传代25次.
图3epc与huvec表达抗原阳性百分率比较（x±s,n=33,bp<0.01vshuvec）
图4epchuvecs体外培养群体倍增曲线
2.3胶原凝胶体外血管生成贴壁的epc和huvec分别消化再种植于i型胶原凝胶上，36h后可见epc伸展呈纺锤状，并相互连接形成管腔样结构（图5a），72h后可见原管腔增大，管壁可见有细胞向管腔中央呈发芽状生长（图5b）.持续观察huvec未见形成管腔样结构，至1wk后仅见细胞呈圆形或多角形融合成片（图5c）.
a：epcs种植36h形成管腔结构；b：72h后管腔扩大，并见管壁细胞向腔内呈发芽状生长；c：huvecs种植不能形成管腔结构.
图5胶原凝胶体外血管生成×100
2.4裸鼠体内血管生成裸鼠22只细胞移植均获成功（epc和huvec组各11只），饲养期间未发现裸鼠有异常反应.移植体病理切片he染色显示，epc组11只裸鼠中有8只在胶原凝胶移植体中观察到了典型的微血管结构，并与小鼠组织构成了人?鼠嵌合血管，其间可见小鼠的血细胞流动（图6a）.而huvec组仅在1只裸鼠的移植体中观察到了类似微血管样结构（图6b），其余10只裸鼠移植体中均显示出不规则的细胞聚集现象，未观察到血管结构（图6c）.
a：epc组细胞移植形成典型血管结构，管腔中可见小鼠血细胞；b：huvec组细胞移植仅1例形成不典型管腔；c：其余huvec组细胞移植均不能形成管腔结构，仅有不规则细胞聚集）.
图6细胞移植裸鼠体内血管生成he×200
3讨论
本研究结果显示，成人外周血循环中的单个核细胞在体外内皮培养条件下，于不同时间段内可形成早期和晚期克隆.yoder等［4］研究表明，这种早期克隆属于单核?巨噬细胞系列，再种植不能分化成内皮细胞，因而还不属于真正的epc.在早期克隆出现后持续培养，直至获得具有内皮细胞形态特征的晚期克隆后，才显现出干/祖细胞和内皮细胞双重生物学特征.因此，这种晚期克隆及其分化产生的近代细胞，应属于真正的epc.本研究显示，epc体外再种植培养可呈现典型“铺路石”外观，与huvec形态相同.两种细胞表达vwf，结合植物凝集素及吞噬乙酰化低密度脂蛋白均为阳性，不表达单核细胞标记cd14而高表达泛内皮细胞标志cd146，提示二者均为内皮细胞来源.与huvec相比，epc表达更高水平的cd34和kdr.由于cd34是多数干/祖细胞的共有标志，而kdr的高表达预示着细胞对血管内皮生长因子更敏感，增殖力和血管生成能力更强［5］.由此可见，我们所获得的晚期克隆来源细胞除了具备成熟内皮细胞的全部表型外，还显现出非成熟细胞（即干/祖细胞）的特征.
本研究显示，在同等培养条件下，晚期克隆来源的epc增殖速度快、传代周期短，在100d时间内传代近50次而无明显衰老征象.相反，huvec虽然在6代以内的生长方式和细胞形态接近epc，但传代周期进行性延长，在2mo的时间内只能传代21次即迅速衰老，说明自我复制能力低下，也符合一般成熟细胞的特点.本研究显示，将晚期克隆来源细胞种植于胶原凝胶中，可生成典型的管腔样结构，而huvec种植后只出现细胞聚集，无典型管腔形成，说明前者具备干/祖细胞和内皮细胞的双重特征.晚期克隆细胞能够在动物体内增殖并形成血管，因而具有epc完整的生物学特征.鉴于冠心病患者外周血循环中出现的内皮细胞是自血管壁脱落的衰老细胞，与huvecs相比在体外更不易存活和增殖［6］.因此有理由相信，我们所获得的晚期克隆细胞属于纯化的epcs，未被成熟血管内皮细胞混杂.
【参考文献】
［1］gothertjr,gustinse,vaneekelenja,etal.geneticallytaggingendothelialcellsinvivo:bonemarrow?derivedcellsdonotcontributetotumorendothelium［j］.blood,2004,104(6):1769-1777.
［2］dimmelers,zeiheram,schneidermd.unchainmyheart:thescientificfoundationsofcardiacrepair［j］.jclininvest,2005,115(3):572-583.
［3］booscj,lipgyh,blannad.circulatingendothelialcellsincardiovasculardisease［j］.jamcollcardiol,2006,48(8):1538-1547.
［4］yodermc,meadle,praterd,etal.redefiningendothelialprogenitorcellsanalysisandhematopoieticstem/progenitorcellprincipals［j］.blood,2007,109(5):1801-1809.
单细胞动物的特征范文
【关键词】高中生物模型研究
中图分类号：G633.91
1.物理模型
以实物或图画形式直接表达认识对象的特征，这就是物理模型。其中DNA双螺旋结构模型的成功就是一个范例。
1.1实物建构模型活化了抽象知识
建立动植物细胞的模型，如动植物细胞的细胞器种类，细胞核、细胞器大小比例，如何体现细胞器之间的协调配合等等。我们采用白色橡皮泥捏成半圆做成细胞质；用白色泡沫塑料做成细胞质基质；用弹力布做成细胞膜；用各色彩泥，捏制成各种细胞器之后，如内质网是捏一条扁平的彩泥之后折叠在一起而成；高尔基体则用二个扁平的彩泥和三个小球表示；核糖体则用若干小球体表示，而且是最小的，并且有较多的放于细胞质中，一部分固定内质网上，用大头针固定于细胞质基质上；用半个蛋壳倒扣在细胞质中表示细胞核。通过模型制作体现了细胞结构和功能上的紧密联系。
1.2图画构建模型提高了识图能力
实物模型在大小、色彩、视觉等方面有着一定的局限性，在日常教学中运用不是很广，但是以图画形式构建模型则相当普遍，如呼吸作用和光合作用、中心法则、各种细胞器结构的静态模型、研究DNA是遗传物质等过程模型、以及人体细胞与外界环境的物质交换模型等。通过多次这样的物理模型的构建，学生养成了一种思维习惯，凡遇抽象的结构或过程，都会尝试用简易的图画帮助理解、思考。而且，在高中生物中，识图能力极为重要。图表是生物科学研究成果的一种重要表现形式，所以在生物高考中注重考查学生读图、识图、析图和绘图的能力。
2.概念模型
概念模型是指以文字表述来抽象概括出事物的本质特征的模型。我们很多学生都存在这样的问题：课本中的单个知识点都掌握得很好，但是在做综合题时总有很多的“想不到”，究其原因是不能迅速地把相关知识联系起来，而构建概念模型可以改变这一状况。
2.1构建概念模型，整合零碎知识
必修1《分子与细胞》，由元素、化合物、细胞结构和功能构建一条主线，围绕以细胞为核心，从外到内逐一规纳，使零碎的知识完整化；如内环境的成分和理化性质（神经-体液-免疫调节）、分泌蛋白的合成运输加工和分泌、生物膜在结构与功能上的联系等构建这样的概念模型；有利于学生对某个单元、某个模块知识进行加工、理解、储存，全面系统地掌握和记忆知识要点，有利于学生形成完整、清晰、系统、科学的知识体系，同时也促进了学生感知、记忆、想象能力的发展。
2.2构建概念模型，简化复杂知识
必修3《稳态与环境》，其中血糖调节是“看不见，摸不着”，又极为复杂。故而教材中安排了一个模型建构活动：“建立血糖调节的模型”，课前，明确胰岛A细胞和胰岛B细胞，它们所分泌的激素及作用，制作好了“糖卡”、“胰岛素卡”、“胰高血糖素卡“；现探究饭后半小时及运动时机体该怎样做才能恢复正常血糖水平，并用卡片进行操作。通过构建动态的物理模型，学生再根据在活动中的体验，构建出了图解式概念模型，将复杂的生理过程简化，不但有利于同学们识记，还能培养分析、综合、概括的思维能力，学会把看似复杂的知识进行整理，找到相关知识的联系，提高灵活运用知识的能力。这样高考中做常见的图形、图表题时，也不会再战战兢兢了。
3.数学模型
数学模型是根据具体情景，抽象出数学规律，并用公式或图表的形式表达。具有解释、判断、预测等重要功能；同时，通过科学与数学的整合，有利于培养学生简约、严密的思维品质。
3.1构建数学模型，辨析易混知识
必修2《遗传与变异》，其中“减数分裂”一节，如减数分裂中同源染色体、四分体、染色体等之间的关系就可以用数学模型来表示：1个四分体=1对同源染色体=2条联会的染色体=4条染色单体=4个DNA分子=8条脱氧核苷酸链，学生通过构建这样的数学模型，很容易地掌握了这几个极易混淆的概念。再联系“DNA的复制”一节，DNA经n次复制所需游离的某种脱氧核苷酸数和第n次复制所需游离的某种脱氧核苷酸数的区别，课上，通过图解分析，师生一起构建了数学模型：n次复制所需游离的某种脱氧核苷酸数=（2n-1）m（注：m为1个DNA分子所含某种脱氧核苷酸数），第n次复制所需游离的某种脱氧核苷酸数=2n-1m，难题立即迎刃而解。
3.2构建数学模型，化解重点难点
必修1《分子与细胞》，其中酵母菌呼吸作用过程中随氧浓度变化所释放的CO2与吸收的O2之间的变化特点、恒定温度条件下测某植物随光照强度变化所释放O2或吸收的CO2、单因子因素与多因子因素对光合作用的影响、有丝分裂过程中染色体、DNA和染色单体的变化曲线等，我们先引导学生构建表格式数学模型，然后转化成直观地坐标曲线，最后再让学生把集合在一张坐标图上，让学生归纳后加以比较，从而化解难点。通过构建数学模型，有利于学生对知识的理解和掌握，也使学生认识到在生物学中有许多现象和规律可以用数学语言来表示，很好地培养了学生的逻辑思维能力。
总之，模型的建构改变了传统的教师满堂灌局面，加强了师生间的互动，体现了新课程改革的理念，通过建构模型能够使生命现象或过程得到简化、纯化，对生物系统的发展状况有了更准确的认识。学生就会主动地去思考探索，顺着科学的思路和方法去感知、去思索，从中领悟和形成运用模型建构方法的能力，在不知不觉中领略科学知识的真谛。
参考文献：
[1]《普通高中生物课程标准（实验稿）》人民教育出版社，2003年4月第1版
单细胞动物的特征范文
关键词:猪繁殖与呼吸综合征;研究进展
中图分类号:S828.3文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)07-0010-04
猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)是1987年首先在美国发现的一种引起成年母猪繁殖障碍(如流产、早产、死胎等)和仔猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,属于接触性传染病。目前该病在世界多数地域均有报道。我国在1996年证实了该病的存在[1]。由于PRRS给全球的养猪业造成了巨大的经济损失,是危害养猪业发展的主要的传染病之一,该病被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。2008年12月11日公布的《中华人民共和国农业部公告第1125号》将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病,将猪繁殖与呼吸综合征(经典蓝耳病)列为二类动物疫病。
目前世界各国投入大量人力物力致力于该病的研究,并取得了较大进展。笔者现从PRRS的病原学特性、致病机理、动物机体免疫以及该病的检测与防制等几方面对该病的研究进展作一简要综述。
1PRRSV的病原学特征
PRRSV由荷兰学者Wensvoort等首次分离并鉴定[2],国际病毒分类委员会第六分类报告将其列为动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,是一种有囊膜的不分节段的单股正链RNA病毒[3]。该病毒基因组RNA的转录机制类似于冠状病毒[4]。
PRRSV在带毒仔猪的脾脏中含量最高,依次是肾脏、肺脏、淋巴结、肝脏、心脏等。PRRSV抗原在死胎体内主要集中于淋巴结和脾脏的巨噬细胞中,在新生仔猪中仅能在肺中检出。对于成年猪该病毒主要位于肺脏等内脏器官以及淋巴结等免疫器官,在生殖道上皮细胞、血管内皮细胞以及、脑等组织的巨噬细胞中也有病毒存在[4]。可以用猪原代肺巨噬细胞、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞等少数几种来培养PRRSV。不同的病毒株,其最适培养细胞有较大差别且其生长繁殖状况也显著不同。有些病毒株在每代细胞上培养3～4d即可出现细胞病变,有些则需要培养2～3代。其细胞病变的特征是:开始细胞的折光性增强,接着呈灶状变圆、突起,72h后细胞开始皱缩并逐渐脱落,细胞病变发展到80%左右时,大部分细胞会脱落,出现空洞[5]。
PRRSV分为以ATCCVR-2332株为代表的美洲株和以LV株为代表的欧洲株两个基因型[6]。纯化的病毒粒子呈球形,直径45～100nm,平均约62nm。核衣壳的直径25～30nm,核衣壳上有约5nm的突起,有脂质双层膜外绕突起,因此该病毒对氯仿、乙醚等脂溶剂和除垢剂较为敏感。在氯化铯和蔗糖密度梯度中浮密度分别为1.13～1.19g/cm3和1.18～1.23g/cm3。PRRSV对高温比较敏感,在56℃下45min即可完全失活。37℃处理10～24h、20℃放置6d或4℃放置1个月,病毒的滴度将下降90%以上。低温、潮湿的环境有利于PRRSV的存活,-20℃和-70℃可保存病毒,在-70℃下,病毒可以保存4个月以上而不影响其感染性。在绝大多数污染物中PRRSV极不稳定,在井水、自来水、PBS水中的存活期为3～11d。在pH7的环境中,PRRSV的感染力可以下降90%以上。PRRSV无凝血活性,不凝集鸡、鸭、山羊、小白鼠及人的红细胞,但用非离子除垢剂处理后,再用脂溶剂处理,可凝集小鼠红细胞[5]。
PRRSV在感染猪体内能诱发中和抗体(neutralizingantibodies,NAs)的产生,但是较低滴度的中和抗体(亚中和水平抗体)不但不能有效清除血液中的病毒,反而与病毒形成病毒-抗体复合物,病毒借助抗体的Fc片段与Fc受体阳性细胞结合,促进病毒进入细胞而建立感染[7],产生所谓的抗体依赖性增强作用(antibodydependentenhancement,ADE)。该作用是PRRSV的一个重要的生物学特征。PRRSV对肺巨噬细胞(PAM)、单核细胞和小胶质细胞的某些亚群有严格的限制性亲嗜性,PAM是其首选的靶细胞,这些细胞的分化和活化状态会影响其易感性。
2PRRSV的致病机理
PRRSV通过呼吸道或生殖道侵入猪体后,主要侵害肺泡及血液等组织的巨噬细胞。首先通过呼吸道与PAM上的受体结合,再经胞吞作用进入PAM,并在PAM内迅速增殖(特别是尚未成熟的PAM最适合PRRSV繁殖),使PAM受损死亡,导致数量减少,存活的PAM表现功能低下,使肺泡功能发生障碍,进而仔猪表现典型的呼吸道症状[6]。
PRRSV感染宿主细胞以及在宿主细胞内进行复制的过程受到宿主细胞的细胞受体、胞内大分子及细胞因子影响。
在PAM中发现了多个PRRSV受体,这与PRRSV感染受体细胞所具有的严格的细胞噬性有关。段小波等使用单克隆抗体Mb41D3与PAM作用,在PAM中找到了PRRSV的受体Sn(唾液酸黏附素)。Delputte等研究发现,PAM表面的硫酸乙酰肝素(HeparanSulfate,HS)也是PRRSV的受体,同时还发现PRRSV中以M-GP5复合物形式存在的病毒基质蛋白是HS受体的主要结合位点,并证明肝素和mAb41D3在共同作用下可完全阻断PRRSV感染PAM[8,9]。
Kim等发现波形蛋白是Marc-145细胞受体。Cafruny的研究表明除了受体外,完整的细胞骨架对于PRRSV在Marc-145细胞间的传播也十分重要。
胞内大分子物质可导致PRRSV在宿主细胞内产生增殖性感染,胞内大分子可以协助病毒脱壳和病毒基因组的释放(CD163和CD151)。包括干扰素在内的细胞因子具有抑制PRRSV在宿主细胞内增殖的作用。
有试验表明感染PRRSV后3～14d内血液中的淋巴细胞及单核细胞也显著降低,说明PRRSV有可能转移到局部淋巴组织的巨噬细胞和单核细胞内进行进一步的增殖[10]。由于巨噬细胞的大量破坏,使其对异物的非特异性吞噬清除功能大为降低,机体的非特异性免疫功能下降。又因PRRSV的增殖可导致PAM减少,使机体的杀菌作用的功能降低,易继发其他细菌或病毒感染,而使疾病的症状加重,这有可能是PRRS常和其他疾病同时存在的根本原因。由于PAM的大量崩解使PRRSV释放进入血液或淋巴,在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖,并分布到全身各组织器官的巨噬细胞内,引起病毒血症及全身淋巴结的肿大等病理变化。猪在接种病毒后24h可出现病毒血症,平均持续约28d,最长可达56d。随着病毒的增殖,机体会出现肺、淋巴结的损伤和以及微循环障碍等,主要表现为特征性间质性肺炎和淋巴结的肿大,支气管坏死和肺的广泛性出血,下领淋巴结、肠淋巴结及扁桃体弥散出血及水肿等。
PRRSV也可感染公猪生殖系统,导致数量减少,使公猪繁殖性能降低,并可通过将PRRSV传染给母猪,引起母猪的繁殖障碍。感染PRRSV的孕猪可引起子宫内胎儿感染,但机制不明。Lager等对繁殖母猪进行攻毒试验,发现怀孕母猪感染PRRSV后可导致胎儿脐带扩张、出血,呈现坏死性脐动脉炎的变化,使得脐血管的正常血液循环受损,造成胎儿缺氧死亡。病理组织学检查发现在流产胎儿的血管周围出现以巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎。
3动物免疫机制对PRRSV的反应
PRRSV感染细胞后可引起机体产生体液免疫和细胞免疫。
PRRSV感染后约1～2周内,猪体免疫系统被激活,产生一系列免疫应答,并可通过几种不同血清学方法检测[11]。感染PRRSV后5～7d,就可在一些猪体内检测到PRRSV抗体(机体首先产生IgG抗体,但亦有报道称是IgM)[12],感染14d后所有猪都会产生抗体。感染14d后IgM达到最高值,在感染42d后迅速下降,直至检测不出。感染后21～49d机体的IgG达到最大值。但IgM和IgG的迅速响应与中和抗体(NAs)的反应并不对应。
Nelson等研究了猪对北美型PRRSV毒株产生体液免疫的过程。最早产生的抗体是针对15kU的核衣壳蛋白(N),随后产生的抗体主要针对19kU的膜蛋白(M),然后产生的是26kU糖蛋白GP5的抗体。另有研究表明非结构蛋白Nsp2中包含一群非中和性抗原决定簇并且有可能是PRRSV的免疫蛋白。很多诊断性检验表明主要免疫原是核衣壳蛋白(N)。这些抗体在感染后一周左右出现并持续存在数月。
在病毒最初感染的4周内,无法用常规的病毒中和试验(virusneutralizationtests,VNTs)检测中和抗体[11]。体外试验表明,中和抗体可抑制PRRSV对巨噬细胞的感染性。研究表明中和抗体效价可以作为评价PRRSV疫苗效力的一个重要参数。
猪感染PRRSV后产生体液免疫的同时,也会产生细胞免疫。单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞是主要的免疫反应。利用北美型PRRSV毒株所制的灭活疫苗接种后,PRRSV特异性的IFN-γ分泌细胞最早在接种3周后出现,以后10周在50万～100万U/百万外周血单核细胞(PBMCs)范围内波动,随后在接种后48周增长到400万～500万U/百万外周血单核细胞。在机体的免疫过程中,干扰素和细胞因子的作用也相当明显。早期研究显示,PRRSV非常容易受I型IFN的影响,并且可以抑制IFN-α的响应,因为在PRRSV复制活跃的猪肺中IFN-α的水平较感染猪圆环病毒等的要低。不同的PRRSV分离株诱导或抑制IFN-α的能力是不同的。感染美洲株或欧洲株的PRRSV后,PBMCs中的IL-10的mRNA水平均有所上升,并且支气管肺泡洗液中白细胞介素10浓度会升高,表明IL-10可能在PRRSV的免疫应答调节机制中起重要作用。
PRRSV可能会阻碍T淋巴细胞的正确抗原递呈和活化作用。尽管PRRSV并不削弱混杂在白细胞反应中的增殖反应,但它抑制主要组织相容性复合体-I(mainhistocompatibilitycomplex,MHC-I)在树突细胞(dendriticcells,DCs)中的表达。与CD14相同,MHC-I和MHC-II在源于单核细胞的DCs中的表达也被抑制,它们可被感染反应激活但不能被PRRSV激活。当被感染的DCs被用作同源或非同源的淋巴细胞时,增生反应明显下降,表明被感染的DCs表现出较低的抗原活性。PRRSV可通过改变巨噬细胞和树突细胞的细胞形态来减轻先天免疫反应,并通过修改(MHC)-I分子的表达来参与抗原递呈。
4PRRSV的检测技术
目前运用于PRRSV检测的方法可分为免疫学检测法以及核酸检测法。免疫学检测包括免疫荧光染色法、免疫过氧化物酶染色法以及免疫胶体金法等。核酸检测法主要是指反转录-聚合酶链式反应检测法(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)。通过检测抗体或抗原水平可以评价猪个体或群体的病毒感染情况以及疫苗免疫效果,目前用于PRRSV抗体或抗原检测的方法主要有免疫荧光抗体(IFA)试验、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)、血清中和(SVN)试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法中ELISA(包括间接ELISA和阻断ELISA)较适于大规模检测,该法方便、易行、操作过程及结果判定能够标准化且具有高度特异性和敏感性。ELISA诊断抗原有2种:从细胞培养物中纯化的全病毒抗原和重组PRRSV核衣壳蛋白。这两种诊断抗原都有较强的背景反应。目前市面上已有PRRSV抗体ELISA检测试剂盒出现,但尚存在假阳性结果。
由Wensvoort等建立的IPMA是目前欧洲和美洲国家广泛使用的血清学诊断方法[2]。该法敏感性和特异性也都很好。有研究表明IPMA可比ELISA试剂盒提前2～3d检测出抗体,尤其是对母源抗体。IPMA的不足主要在于其结果判定不能自动显示、有一定的主观性,检测时间长,花费大,不适合大规模检测。而ELISA方法可以在不损失特异性的基础上提高敏感性,相比而言,ELISA方法更适合诊断PRRSV。
IFA同IPMA一样,结果判定也有较大的主观性,用IFA法检测抗体滴度较低的血清可能会出现假阴性结果。血清中和试验同其他几种方法相比敏感性较低,可能是由于PRRSV特异性中和抗体出现较晚。
RT-PCR方法扩增的目的片段主要针对PRRSV的核衣壳蛋白的编码基因。该方法省时、省力且敏感性、特异性等明显高于病毒分离和ELISA。目前该方法广泛应用于PRRSV的鉴定和临床诊断。血清、、肺脏等都可以作为该法的检验样品。近年来荧光定量RT-PCR[13]、逆转录恒温扩增技术(RT-LAMP)[14]的发展,为PRRSV的早期快速诊断提供了有力工具。
5PRRS的控制方法及疫苗研究进展
对于控制PRRS来说,保证饲料原料的质量、加强通风、保证饮水、减少应激以及做好隔离淘汰等工作是整个控制工作中最重要的一步。
及时接种疫苗也是预防PRRS的重要方法。目前PRRS的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗等。灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险、便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点,因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。有报道称PRRS的某些灭活疫苗接种猪后可以减少病毒血症的发生、有效阻止肺部病变,可提高母猪的繁殖力、改善死胎状况。接种灭活疫苗20d左右,体内抗体可达到高峰,并可持续6个月左右。弱毒疫苗有免疫力强、免疫期长等优点,适用于3～18周龄的猪。Mengeling等发现母猪怀孕后期接种某种弱毒疫苗后可产生病毒血症。弱毒疫苗在接种后,可能会持续散播疫苗病毒,使得病毒在猪场中传播,甚至可能引发PRRS的暴发。因此,目前世界上并不提倡使用弱毒疫苗,例如在欧洲(如德国等)禁止用活疫苗来预防PRRS,美洲和亚洲的某些国家提倡在未发生PRRS的猪场中避免使用弱毒疫苗。基因工程疫苗主要包括核酸疫苗、重组疫苗和活载体疫苗等。核酸疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫,且对不同血清型的毒株具有交叉保护性,另两种基因工程疫苗尚还处于研究探索阶段[15,16]。
6展望
目前,国内外学者对PRRS的研究虽然已取得重要进展,但在某些方面仍有待深入研究,包括PRRS的发病的详细机制,PRRSV的免疫学机理,PRRSV的快速、特异、敏感性更好的检测方法以及接种效果更好的疫苗等。近年来,PRRS的频繁暴发,给世界养猪业以及人类的经济发展都带来重大损失,该病的研究还需广大科研工作者付出更大的努力。相信在国内外学者的关注下,这些问题终将被一一解答。
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