分红合同范例(3篇)

分红合同范文

【摘要】目的从已分离的具有红景天苷转化能力的霉菌中，筛选能协同发酵红景天苷的双菌株组合。方法以重氮盐比色法初步确定菌株组合和双菌株协同主要发酵条件，并用高效液相色谱(hplc)法复筛。结果选出的最优双菌株组合编号为35-42，该组合在最优发酵条件下，发酵后红景天中红景天苷和酪醇含量比原药材分别提高86.29%和118.14%，总有效成分提高94.68%。结论表明双菌株的协同转化作用明显优于单菌株。

【关键词】双菌株发酵；红景天苷；酪醇；重氮盐比色法；高效液相色谱

红景天为景天科（crassulaceae）红景天属rhodiolacrenulatahook.f.etthoms植物的根及根茎［1］，我国红景天资源大多分布在高寒地区。其有效成分主要是红景天苷及其苷元-酪醇，二者均具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等作用。红景天制品是抗高原反应的必备品。随着红景天产品广泛开发和应用，过度采挖使天然资源日趋枯竭［2］，对高原藏区生态环境的破坏严重。因此，保护性开发野生资源，提高红景天有效利用率显得更加重要。在其他一些植物药材中，苷是从无活性的苷元脱去糖基获得的，可以采用酸解或酶法来水解糖基，简便易行。与之不同，红景天苷和苷元生成是合成代谢，其前体来源不太清楚，从而造成提高其有效成分研究的难度。目前已有的研究主要包括：添加前体物和酶催化剂合成红景天苷、化学合成法［3］、植物细胞组织培养和基因克隆等方法［4,5］，但与应用还有不小距离。文章在前期研究中，已分离到对红景天苷具有转化能力的菌株，通过单一菌株发酵，最高可使红景天原药材中苷含量提高52.83%。本研究进一步采用双菌株协同发酵红景天，使其中苷含量大大高于单一菌株发酵。混合菌株发酵提高红景天苷和酪醇含量研究还未见报道,为利用生物技术提高野生藏药材资源利用率提供新途径。

1材料

红景天购于成都五块石药材市场，经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科（crassulaceae）红景天属rhodiolacrenulatahook.f.etthoms。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20min，过滤，取滤液，加mgso40.05%，kh2po50.1%，(nh4)2so40.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。

2方法

2.1培养方法

2.1.1孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。

2.1.2菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200r/min，时间48h。

2.1.3红景天发酵培养30℃，200r/min，时间为2～4d。

2.2提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和hplc检测。

2.3测定方法

2.3.1重氮盐比色法［6］取发酵提取液5ml，加入10%的醋酸铅5ml和饱和硫酸钠2ml，定容至25ml，沉淀、离心，取上清液5ml于20ml比色管中，其中加2%碳酸钠3ml及重氮化试剂3ml，摇匀显色5min，再加5%氢氧化钠0.5ml，显色15min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。

2.3.2hplc检测［7］色谱条件：岛津lc-6a高效液相色谱仪；色谱柱为ywm-c18(10u)200nm×4.6mm；流动相为v（甲醇）：v（高水）=25∶75；检测波长275nm；自然ph；柱温为室温；进样量：20μl；流速1.0ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00mg，分别置于25ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6μl，测定峰面积，以峰面积（y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（x/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。

3结果

3.1双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和hplc进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果，与hplc测定值有较好的相关性（另文发表）。从已分离到的微生物中，选出发酵能力较高的8株霉菌，两两组合，接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵，并与单菌株发酵比较。结果见表1和图1。表1双菌株发酵红景天总有效成分测定（略）

由表1及图1可以看出，22种双菌株组合中，83.33%的高于对照，22.72%高于单菌株发酵，其中有4对组合高于对照170%以上（高于单菌株发酵29.27%以上）。

3.2双菌株复筛以峰面积（y）与对照液中红景天苷的量（x/μg）作回归计算，结果表明红景天苷含量在2.00～12.00μg范围内线性关系良好，回归方程为：y=7684080.0429x+64169.2619，r=0.9997（n=6）；以峰面积（y）与对照液中酪醇的量（x/μg）作回归计算，结果表明酪醇含量在2.00～12.00μg范围内线性关系良好，回归方程为：y=1180000x-7624.23，r=0.9998（n=6）。将初筛中有效成分最高的7个双菌株组合，接种于红景天发酵培养基中发酵，用hplc测定其中红景天苷和酪醇的含量，算出百分含量。结果见表2及图2。表2双菌株发酵红景天苷和酪醇的含量（略）

由表2可以看出，在单菌株发酵中，红景天苷和酪醇分别以35号和49号菌株最高；双菌组合发酵后，酪醇含量均低于49号单菌株，但35-42菌株组合发酵后红景天苷和总有效成分含量，均明显高于所有单菌和其余双菌株发酵。35-42组合发酵后红景天苷、酪醇和总有效成分分别比原药材提高44.36%，26.83%和39.74%，均高于所组合的单一菌株35号和42号。

3.3接种方式的确定将7种双菌株组合分别采用孢子悬液和菌丝体进行接种发酵，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。结果见表3。表3孢子悬液和菌丝体接种发酵的比较（略）

由表3可以看出，以孢子悬液接种发酵，发酵提取液吸光度平均值为0.522，而以菌丝体接种，发酵提取液吸光度平均值为0.561，后者约是前者的1.055～1.120倍。表明用菌丝体接种优于孢子悬液。在这两种接种方式中，均以35-42菌株组合最好，因此选定该双菌株组合作进一步试验。

3.4主要发酵条件的优化以35-42为组合菌株，通过正交实验对红景天主要发酵条件进行优化，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。结果见表4。表435-42双菌株组合发酵正交实验设计（略）

通过正交实验得到红景天发酵最佳条件为；接种量10％、固液比1∶10、生长时间60h。试验结果表明，接种量过大时，菌体之间相互缠绕，不利于菌体的发酵；固液比过低，发酵液中营养成分过低，限制菌体生长；时间太短，影响前体的产生和红景天苷及酪醇的合成。

3.5双菌株接种比例的确定以正交实验所得最佳条件为基础，将35号和42号菌株以不同比例混合接种发酵红景天，通过hplc来检测红景天苷和酪醇含量，求得百分含量。结果见表5。表535-42双菌株不同接种比例组合发酵后红景天苷和酪醇含量（略）

由表5可得，35-42双菌株混菌比例为2∶8时红景天苷和总有效成分最高，这是由于混菌发酵利用不同菌株作用效果的差异，适宜的接种比例可以使代谢协调，从而提高产率。

3.635-42双菌株组合的发酵曲线和发酵时间的确定以hplc测定35-42双菌株发酵不同阶段红景天苷和酪醇的含量。结果见图2。

由图2可以看出，双菌株组合接种6h后红景天苷逐渐增加，在60h达到最大值，此后逐步降低。酪醇含量在0～54h内变化不大，但在红景天苷接近峰值时，开始下降，总有效成分在54h达到最大值，此后，随着酪醇的下降而降低。由于红景天质量检验是以苷的含量为准，因此将发酵时间确定为60h。

3.7最优发酵条件下双菌株发酵液中红景天苷和酪醇含量分析按照以上确定的最佳发酵条件，即：菌丝体接种，接种量10%，双菌株的混菌比例为2∶8，配料水比为1∶10，30℃200r·min-1条件下转化发酵60h，以红景天原药材提取液以及单菌发酵的提取液作对照。单菌和双菌发酵提取液均与原药材提取液的测定稀释度相同（含相同原始质量的红景天原药材）。用hplc检测红景天苷和酪醇并测定含量，结果如图3～6。

由图4～6的hplc色谱图显示，红景天原药材提取液、单株菌发酵和双菌株发酵的提取液中，在3.8min和11.2min均出现吸收峰，红景天苷标准品和酪醇标准品的保留时间一致。35-42双菌株发酵的吸收峰面积明显大于原药材对照以及单株菌发酵液的吸收峰面积。hplc测定数据见表6，结果表明，经过35-42双菌株发酵后，红景天中红景天苷含量提高86.29%，酪醇含量提高118.14%，总有效成分提高94.68%。红景天发酵液中红景天苷和酪醇含量与原药材对比，结果见图7～9。表635-42双菌株在优化发酵条件下红景天苷和酪醇含量分析（略）

4结论

本研究通过筛选微生物双菌株对红景天原药材进行发酵，可以显著增加红景天苷和酪醇的含量。微生物具有丰富的代谢多样性和很强的代谢能力，高等植物体内所有的代谢途径，在微生物中都有可能存在并且活性更强。在红景天苷合成中，通过苯丙烷类代谢途径，为酪醇的合成提供含苯环的碳架结构，再由转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖与酪醇与合成红景天苷。本研究所用真菌与红景天同属真核生物，能催化前体转化为红景天苷和酪醇，可能具有与红景天中类似的部分酶及代谢途径，并能产生淀粉酶、蛋白酶等胞外水解酶，在红景天原料上生长时，分解植物组织，促进物质的溶出，产生更多的前体物，为红景天苷和苷元合成提供充足的物质来源。红景天苷和苷元的合成需要多种酶的催化，而单一菌株很难在多个环节上同时提高中间代谢物的量。双菌株发酵中，酶系比例相对协调，形成代谢协同作用，使红景天苷含量大大提高。

经初步测算，双菌株发酵使红景天原药材中红景天苷提高86.29%，已大大超过盈亏平衡点，具有很强的应用前景。后续需要在菌种选育、发酵机理、药效和中试工艺条件进行研究。

【参考文献】

1］龚晨睿，李宇红，马良．红景天复合制剂抗疲劳作用研究［j］.卫生研究，2002，31(5)：397.

［2］包文芳，吴维春，李葆华，等．抗疲劳药用植物红景天［m］.北京：人民军医出版社．2004，2：1．

［3］张莉，赵淑月，郑恺，等．红景天植物的抗自由基作用研究［j］.长春中医学院学报，2002，18(1)：44．

［4］王莉．长鞭红景天细胞悬浮培养及其次生代谢调控研究［d］.北京：北京林业大学药用植物学，2007．

［5］贾艳萍，郭宏艳，张春枝，等．微生物酶合成红景天苷的条件优化［j］.大连轻工业学院学报，2004，23（2）：97.

分红合同范文

[关键词]红景天苷；化学合成；生物合成；综述

[稿件编号]2013-07-28

[基金项目]北京中医药大学自主选题项目

[通信作者]*王如峰，副教授，主要从事中药化学成分及生物转化研究，Tel：（010）84738646，E-mail：wangrufeng@tsinghua、org、cn

[作者简介]吴秀稳，硕士研究生，主要从事药物代谢研究，Tel：（010）84738646，E-mail：wuxiuwen0725@126、com红景天苷（salidroside）是景天科Crassulaceae红景天属Rhodiola植物的主要有效成分之一。药理研究表明，红景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤等明显功能，而且还具有增强免疫力、延缓机体衰老、机体双向调节等功效，在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物[1]。天然红景天植物野生资源极其有限，其中红景天苷的含量极低，而且红景天苷的提取工艺复杂，这使得从天然药物中提取红景天苷的收率低且纯度差，因此发展替代生产途径十分重要，而利用化学合成方法和生物技术是发展替代生产途径的重要手段。本文对红景天苷的化学合成方法、生物合成途径及利用植物组织培养、细胞培养、生物酶法、毛状根培养技术和代谢工程技术生产红景天苷相关的细胞与分子生物学最新研究进展进行了综述。

1化学结构

红景天苷（图1）是糖的半缩醛羟基与醇羟基脱水形成的醇苷，是一种由葡萄糖与酪醇以苷键结合而成的糖苷，酪醇为其苷元。

图1红景天苷的化学结构

Fig、1Structureofsalidroside

2化学合成

目前化学合成红景天苷主要有以下几种途径。

2、1酪醇的直接糖苷化

苏联学者TroshenkoAT等[2]于1969年最先报道了红景天苷的合成方法，将溴代四乙酰基葡萄糖与酪醇直接缩合并脱乙酰基，得到红景天苷（图2）。明海泉等[3]于1983年在国内首次合成了红景天苷，其工艺包括：用酪醇和溴代四乙酰基葡萄糖经缩合得中间体四乙酰基红景天苷，再脱乙酰基得到红景天苷（图3）。纪淑芳等[4]进一步用2-（对氨基苯基）乙醇制得酪醇，用过量的酪醇与溴代四乙酰基葡萄糖成苷，再脱去乙酰基，得到红景天苷，其收率达到33%（图4）。

图2TroshenkoAT的合成法

Fig、2SyntheticmethodreportedbyTroshenkoAT

图3明海泉的合成法

Fig、3SyntheticmethodreportedbyMingHaiquan

2、2酚羟基保护的酪醇糖苷化

由于酪醇分子中同时存在醇羟基和酚羟基，以酪醇直接糖苷化制备红景天苷的方法也能使酪醇中的酚羟基糖苷化，产生副反应。为了克服上述缺点，李国青等[5]、张三奇等[6]、

图4纪淑芳的合成法

Fig、4SyntheticmethodreportedbyJiShufang

邓梅等[7]分别用苄基、烯丙基或酰基先将酚羟基保护，再与溴代四乙酰基葡萄糖缩合制备红景天苷（图5～7）。

图5李国青的反应法

Fig、5SyntheticmethodreportedbyLiGuoqing

图6张三奇的反应法

Fig、6SyntheticmethodreportedbyZhangSanqi

图7邓梅的反应法

Fig、7SyntheticmethodreportedbyDengMei

许大艳等[8]则以对氨基苯乙醇为原料，经重氮化和水解反应制得酪醇，再与苄氯反应，其产物与溴代四乙酰基葡萄糖缩合，最后催化氢化合成了红景天苷，总收率可以达到66%～70%（图8）。

李中军等[9]以一些价廉的Lewis酸为催化剂，利用稳定性好、价廉易得的β-D-五乙酰葡萄糖作为供体，以酰基保护酚羟基的酪醇为糖基化受体进行苷化反应，得到红景天苷，其总收率为35%～50%（图9）。

图8许大艳的反应法

Fig、8SyntheticmethodreportedbyXuDayan

图9李中军的反应法

Fig、9SyntheticmethodreportedbyLiZhongjun

史明明[10]以葡萄糖为起始原料，经多步反应制备4种不同的糖苷化供体，然后进行糖苷化反应，最后成功地合成了红景天苷。4种糖苷供体依次为2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、2，3，4，6-四-O-α-苄基-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、1-溴-2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖。但是，该方法还存在一定的缺陷，仍需要进一步的优化。

3生物合成

尽管化学合成红景天苷及其类似物技术已日趋成熟，但大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，而生物合成具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，在合成红景天苷方面显示出优越性。因此，红景天苷的生物合成途径和方法越来越受到关注。

3、1生物合成途径

红景天苷的生物合成包括苷元酪醇的合成与酪醇和葡萄糖结合2个方面，可分为4个阶段：一是初生代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E-4-P）经莽草酸途径形成莽草酸；二是由莽草酸再经几步酶促反应形成阿罗酸；三是由阿罗酸到酪醇的合成；四是由葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷。在这4个阶段中，第1阶段是许多高等植物所共有的代谢步骤，是十分明确的；第2阶段的反应机制也基本被探索清楚；第4阶段植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDPglucosyltransferase，UDPGT，UGTs）以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和酪醇为底物催化合成红景天苷；关于第3阶段，从阿罗酸到酪醇的生物合成途径，已经提出了3条可能的途径，即苯丙烷类代谢途径、酪氨酸脱羧代谢途径和酪氨酸转氨代谢途径[11]。

在苯丙烷类代谢途径中，苯丙氨酸由苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化脱掉1分子氨后形成反式肉桂酸。反式肉桂酸在芳香环的对侧发生羟基化即转化为对-香豆酸。关于对-香豆酸转化为酪醇的途径存在两种可能性。一种可能途径是对-香豆酸由对-香豆酸脱羧酶催化直接生成酪醇；另一种更为复杂一点的可能途径是对-香豆酸先由4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）催化生成对-香豆素辅酶A，依次由香豆素辅酶A还原酶（CCR）催化生成对-香豆醛，由香豆醛脱氢酶（CAD）催化生成对-香豆醇，最后由对-香豆醇生成酪醇。由对-香豆醇生成酪醇可能需要至少两步反应，目前还不太明确。在酪氨酸脱羧代谢途径中，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶（TyrDC）的作用下生成酪胺，酪胺在单胺氧化酶的催化下转化为对-羟苯乙醛（4-HPAA），而在酪氨酸转氨代谢途径中，酪氨酸在酪氨酸转氨酶（TAT）的作用下生成对-羟苯丙酮酸（4-HPP），对-羟苯丙酮酸（4-HPP）在脱羧酶的作用下生成对-羟苯乙醛（4-HPAA），对-羟苯乙醛（4-HPAA）在还原酶催化下转化为酪醇，最后酪醇在葡萄糖苷转移酶的催化下与葡萄糖结合生成红景天苷[12-13]。

在上述3条途径中，苯丙烷类代谢途径是人们最容易想到的，因为酪醇分子属于典型的酚类化合物，而植物体内的大部分酚类化合物均来源于此途径，为酪醇的合成提供了碳架结构最为相似的前体化合物来源。但是在随后的研究中，马兰青等[14]证实了酪氨酸脱羧代谢途径的存在，并通过构建苯丙氨酸解氨酶基因（PALts1）植物表达载体并转化回红景天的方法发现PALts1的过表达和4-香豆酸的积累不能促进酪醇的合成，另一方面4-香豆酸生成酪醇需要脱羧反应，而植物中不存在此类反应，因此否定了酪醇来源于苯丙烷代谢途径的可能性，推断其生物合成来源于生物碱代谢途径。

3、2生物合成方法

3、2、1组织培养技术利用组织培养技术生产红景天苷主要体现在红景天的组织培养上。红景天组织培养的研究工作主要集中在以下3个方面：一是对不同种类的组织培养与快速繁殖技术进行研究；二是针对不同的种类、同一种类的不同器官或组织，以及相同外殖体的不同培养阶段来筛选理想的培养基配方和培养条件的配置；三是利用组织培养方式来进行相关的其他研究，如探索红景天苷的生物合成途径、提高培养组织中红景天苷的量等。李伟等[15]对狭叶红景天和大花红景天不同外植体的组织培养进行了探索，找出了不同外植体在不同培养阶段的理想培养基配方和培养条件配置。张瑜等[16]分别以高山红景天的幼茎和幼叶作为外植体，以MS为基本培养基，研究不同激素配比对高山红景天愈伤组织的诱导、继代、生根的影响。结果发现幼茎是最佳的外植体；愈伤组织诱导最佳的培养基为MS+6-BA（3mg・L-1）+NAA（0、5mg・L-1），诱导率达83、3%；不定芽诱导和增殖的最佳培养基为MS+6-BA（2mg・L-1）+NAA（0、1mg・L-1），诱导率和增殖率高达72%，且产生的不定芽数量较多；生根培养基以MS+IAA（0、5mg・L-1）为最好，生根率为100%，而且幼苗长势旺盛。张雪莲等[17]以高山红景天的种子和试管苗的茎、叶为外植体诱导愈伤组织，继代培养6次，测定每代愈伤组织中红景天苷的含量，得出高山红景天中红景天苷含量与外植体和继代次数相关的结论，为培育高红景天苷植株提供了依据。

3、2、2细胞培养技术利用细胞培养技术生产红景天苷主要体现在红景天细胞的悬浮培养上。艾江宁等[18]研究了高山红景天悬浮细胞生长和红景天苷合成动力学特征，发现其悬浮培养的生长周期约为16d，0～4d为细胞的延滞期，4～12d为对数期，13～15d为稳定期，在第14d细胞鲜、干质量达到最大，红景天苷含量在培养的第12d达到最高，其质量分数为0、59%。王莉等[19]探索了基本培养基、激素、碳源、氮源等因素对长鞭红景天细胞生长和红景天苷产量的影响，确定了长鞭红景天细胞悬浮培养体系的最适培养条件，即MS培养基+BA（5、0mg・L-1）+2，4-D（0、1mg・L-1）+蔗糖（30g・L-1），建立了高产红景天苷的细胞悬浮培养体系。魏欣方等[20]在红景天悬浮细胞培养起始期分别添加苯丙氨酸、肉桂酸和酪氨酸3种前体，结果3种前体在合适的浓度下均能促进细胞中红景天苷的生物合成，苯丙氨酸的最佳添加质量浓度为20mg・L-1，肉桂酸和酪氨酸的最佳添加质量浓度均为10mg・L-1。

3、2、3生物酶法利用生物酶法合成红景天苷主要体现在红景天苷合成的最后一步中，即酪醇与葡萄糖在酶的作用下脱水形成糖苷。以廉价易得的酪醇和β-D-葡萄糖为原料，采用分离纯化的糖苷酶或者筛选构建的红景天苷高转化菌株合成红景天苷。ZhangLei等[21]首次报道了利用微生物酶合成红景天苷，从黑曲霉MS-48中分离纯化一个大小为84、6kD的糖苷酶Salidrosidase，在p-酪醇质量浓度为15g・L-1、β-D-葡萄糖质量浓度为60g・L-1，温度45、8℃，pH5、0的条件下反应6h，红景天苷的产率为10%。Tong等[22]首先利用从苹果种子粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在二氧六环水混合体系中催化酪醇和β-D-葡萄糖合成了红景天苷，收率为15、8%。HiroyukiAkita等[23]从杏仁粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在叔丁醇-水混合系统中分别与7种不同的取代醇反应，合成了一系列红景天苷类似物，产率适中，在11%～22%。王梦亮等[24-25]从红景天根系土壤中筛选出了5个菌株，通过比较5个菌株合成红景天苷的能力，确定米曲霉为合成红景天苷的出发菌株，以葡萄糖和酪醇为底物合成红景天苷；利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶，催化合成红景天苷，提高了红景天苷的转化率。高雪华等[26]采用微生物固体和液体发酵法，通过硫酸铵沉淀法从黑曲霉H35和H42的发酵液中提取合成红景天苷和酪醇的红景天苷合成酶系和酪醇合成酶系，通过酶促反应提高了红景天苷和酪醇的含量。

3、2、4毛状根培养毛状根培养是近10年发展起来的一种新的培养系统，生长速度快、分枝多、弱向地性，有稳定的次生代谢物合成能力，因此可大量培养替代稀缺野生资源。目前，红景天的毛状根诱导已取得成功，培养体系也已建立。徐洪伟等[27]利用发根农杆菌A4，R1601，ATCC15834菌株侵染高山红景天子叶和子叶节诱导获得毛状根，并对转化工程中侵染时间、菌体浓度、共培养时间等参数进行了优化，从而获得高产量的红景天苷。胡耀辉等[28]以双元表达载体pCAM-BIA1301为基础，用烟草根特异性启动子TobRB7和葡萄糖基转移酶基因UGTR分别取代双元表达载体中的CaMV35S启动子和GUS基因，从而获得了烟草根特异性启动子驱动葡萄糖基转移酶基因的表达载体，命名为pCA-Tob7：UGTR，并整合到了红景天发状根基因组中，为进一步研究特异性启动子对红景天苷合成的调控作用奠定了基础。尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）和酪氨酸脱羧酶（TyDC）是红景天苷生物合成的2个关键酶，目前还没有酪氨酸脱羧酶基因转入红景天毛状根的报道，是一个值得研究的方向。

3、2、5代谢工程技术利用代谢工程技术生产红景天苷的前提是分离和鉴定红景天苷代谢途径中的功能基因，从而为代谢工程提供候选基因，以及明确代谢途径中的限速步骤，以便为代谢工程提供理想的作用靶点。近年来有不少研究者在与红景天苷合成有关基因的克隆与转化方面取得了良好的成果。李伟[29]于2003年成功克隆了大花红景天的苯丙氨酸解氨酶基因；马兰青[30]于2005年克隆了高山红景天的苯丙氨酸解氨酶基因（命名为PALc11）和UDP-葡萄糖基转移酶基因（命名为UGT1）。Gyrgy[31]于2006年克隆了一个编码玫瑰红景天酪氨酸脱羧酶的cDN段，根据这个基因在其根和叶中的表达分析，证实了酪氨酸脱羧酶在红景天苷生物合成中的重要作用。张继星[32]在2007年成功克隆了高山红景天的酪氨酸脱羧酶基因（命名为TyrDC1）和UDP-葡萄糖基转移酶基因（命名为UGT3）。于寒松等[33]在2008年成功克隆了高山红景天糖基转移酶基因家族里的3种基因（命名为UGTC1，UGTC2，UGTR），并利用CODEHOP方法克隆了高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDN段。

4展望

红景天苷药用功效显著，其来源备受世人关注。人工培育红景天苷高含量的红景天植物栽培品种所需的生境要求高，劳动成本大，很难满足日益增长的需求；红景天苷化学合成过程中掺入化学试剂，应用于食品行业受到很大限制；采用现代生物技术来提高红景天植株的红景天苷含量或另外开辟红景天苷的生物合成途径成为解决问题的有效方式。红景苷生物合成研究的不断深入，以及功能基因组学、代谢组学和生物信息学研究手段的不断丰富，使得准确阐明红景天苷整个生物合成途径的分子机制，并实现其代谢工程的生物合成已不再遥远。

总之，利用基因工程遗传改良红景天属植物，开展红景天苷代谢工程研究，进而利用细胞工程生产红景天苷具有很大优势。大量的细胞实验证实利用细胞工程手段生产红景天苷是可行的，目前需要解决的是工艺参数的优化，而越来越多的分子生物学证据显示红景天苷生物合成中起到限制性的因素是酪氨的积累，这可能存在反馈抑制。借鉴前人的研究思路，如获得酪氨反馈不敏感红景天突变株，可能会大大提高红景天苷的含量。因此，利用基因工程、细胞工程结合代谢工程是将来生产红景天苷的理想途径，红景天苷生物合成分子生物学研究、细胞工程研究和代谢工程研究在这方面将起到决定作用，为最终实现红景天苷商业化生产奠定基础。

[参考文献]

[1]曹晓钢，于刚，王立军、红景天苷的研究进展[J]、食品与药品，2007，9（7）：48、

[2]TroshchenkoAT，YuodvirshisAM、Synthesisofglycosidesof2-（p-hydroxyphenyl）ethanol（tyrosol）[J]、ChemNatCompd，1969，5（4）：217、

[3]明海泉，夏光成，张瑞钓、红景天研究进展[J]、中草药，1988，9（5）：37、

[4]纪淑芳，周亚青、红景天甙的合成[J]、沈阳药学院学报，1987，4（3）：192、

[5]李国青，李展、红景天苷合成方法改进[J]、中国药物化学杂志，1996，6（2）：136、

[6]张三奇，尚刚伟、合成红景天苷的新途径[J]、中国药物化学志，1997，7（4）：256、

[7]邓梅，吴振刚，刘雪英、红景天苷及其类似物的合成[J]、第四军医大学学报，2007，28（16）：1501、

[8]许大艳，刘大有、红景天苷的合成[J]、长春中医药大学学报，2009，25（4）：614、

[9]李中军，李辉，马庆，等、一种适于产业化的红景天苷化学合成方法：中国，20111018419、0[P]、2012-01-04、

[10]史明明、红景天苷的合成方法研究[D]、长沙：湖南师范大学，2012、

[11]张祖荣，廖志华、红景天苷的生物合成途径及生物技术研究进展[J]、中草药，2010，41（9）：1571、

[12]张继星，于寒松，王慧然，等、高山红景天酪醇生物合成途径的探讨[J]、内蒙古民族大学学报：自然科学版，2007，22（5）：540、

[13]史玲玲，王莉，张艳霞，等、红景天甙的生物合成及其关键代谢酶研究[J]、生命科学，2008，20（2）：287、

[14]马兰青，柳春梅，于寒松，等、红景天甙生物合成途径：酪醇合成的起始反应及其糖基化[J]、生物工程学报，2012，28（3）：282、

[15]李伟，杜桂森，黄勤妮、狭叶红景天愈伤组织中红景天甙含量及相关代谢酶活力的研究[J]、西北植物学报，2005，8：152、

[16]张瑜，卞勇，关力，等、高山红景天的组织培养与快速繁殖[J]、黑龙江医药，2013，26（6）：37、

[17]张雪莲，金日，刘宪虎，等、高山红景天不同继代愈伤组织中红景天甙含量研究[J]、安徽农业科学，2009，37（30）：14705、

[18]艾江宁，贾景明、高山红景天细胞悬浮培养生长和产物积累动力学[J]、沈阳药科大学学报，2009，26（8）：653、

[19]王莉，管江红，史玲玲，等、长鞭红景天细胞悬浮培养体系优化研究[J]、中草药，2012，43（11）：2272、

[20]魏欣方，周斌，贾景明、3种前体饲喂对高山红景天悬浮培养细胞中红景天苷的影响[J]、中国实验方剂学杂志，2010，16（15）：83、

[21]ZhangL，DingRX，ChaiYR，etal、EngineeringtropanebiosyntheticpathwayinHyoscyamusnigerhairyrootcultures[J]、ProcNatlAcadSciUSA，2004，101（17）：6786、

[22]TongAM，LuWY，XuJH，etal、Useofappleseedmealasanewsourceofβ-glucosidaseforenzymaticglucosylationof4-substitutedbenzylalcoholsandtyrosolinmonophasicaqueous-dioxanemedium[J]、BioorgMedChemLett，2004，14（9）：2095、

[23]AkitaH，KawaharaE，KishidaM，etal、Synthesisofnaturallyoccurringβ-D-glucopyranosidebasedonenzymaticβ-glycosidation[J]、JMolCatalB-Enzym，2006，40（1/2）：8、

[24]王梦亮，张芳，刘滇生、微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究[J]、催化学报，2006，27（3）：233、

[25]王梦亮，李万丽、固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究[J]、生物技术，2009，19（1）：68、

[26]高雪华，雷蕾，邓小晨、微生物酶的方法提高红景天苷和酪醇的研究[J]、时珍国医国药，2011，22（9）：2137、

[27]徐洪伟，周晓馥、高山红景天毛状根培养的研究[J]、中国生态农业学报，2003，11（3）：45、

[28]胡耀辉，刘蓓蓓，于寒松、烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对红景天发状根的转化[J]、中药材，2011，34（6）：864、

[29]李伟、红景天组织培养及红景天甙相关代谢酶的研究[D]、北京：首都师范大学，2003、

[30]马兰青、高山红景天红景天苷生物合成相关基因的克隆及功能分析[D]、长春：吉林大学，2005、

[31]GyrgyZ、GlycosideproductionbyinvitroRhodiolaroseacultures-ActaUniversitatisOuluensis：Technica，Vol、244[D]、Ouluensis：OuluUniversity，2006、

[32]张继星、二种与高山红景天红景天甙生物合成相关基因的分离及功能研究[D]、长春：吉林大学，2007、

[33]于寒松，张继星，马兰青，等、利用CODEHOP方法克隆高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDN段[J]、吉林农业大学学报，2008，30（2）：150、

Researchprogressofalternativeproductionapproachesofsalidroside

WUXiu-wen，PENGYu-shuai，WANGRu-feng*

（SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China）

[Abstract]Salidroside，oneoftheactivecomponentsofRhodiolaplants，isaphenolicglycosidewithsignificantbiologicalactivities、TheinvestigationanddevelopmentofalternativeproductionapproachesofsalidrosideisofhighacademicandapplicationvaluesduetothelimitedresourceofRhodiolaplants，andfromwhichthelowyieldofsalidroside、Thisreviewsummarizedtheresearchprogressandperspectiveofthealternativeproductionapproachesofsalidrosideincludingbothchemosyntheticandbiosyntheticmethodsandpathways、

分红合同范文篇3

【关键词】红松母树；经营管理；效益

0.引言

红松是桦南县林业局重要的经济树种，全局现仅有红松林3450hm2，红松材质优良，且种子可食用，营养价值高。近10年来红松种仁远销国外，最高市场价格达200元/kg，红松种子价格达80元/kg。由于高额利益的驱使，人们便对其抢采掠青，致使枝桠和树头被毁，母树及种子资源遭到严重破坏。各级林业部门每年都采取相应措施打击抢采掠青和非法买卖红松种子，但效果不明显。随着资源逐渐危困，充分发挥红松林的效益，是一个亟待解决的问题。

1.实行红松母树承包经营合同化管理

为切实做好红松母树保护，杜绝抢采掠青红松种子现象，2002年，桦南县林业局各林场事业区实施了红松母树林承包经营合同化管理试验。

1.1承包经营合同化管理的原则及办法

管理的原则是将红松母树林承包给本场内具有经营保护红松母树和采种能力的职工，林场与职工签定承包经营合同，既为职工脱贫致富开辟新路，又有利于对红松母树的保护。

承包经营采取“四定”、“三包”、“二保”的管理办法。“四定”即定面积、定株数、定人员、定期限；“三包”即包管护、包抚育、包采种；“二保”即保质量、保上缴。

在逐株详查的基础上，按小班对每株母树进行统一编号、挂号、设立承包经营标示牌，标明承包区的林班、小班、面积、红松母树株树、承包人、承包日期，建立红松母树档案。根据调查，以户承包、联户承包，组成联合承包小组，每个小组选出承包人与林场签订红松母树承包合同。合同中明确规定承包期限、承包人的权力和义务。承包人必须按时向场方交纳保证金[1][2]。

1.2母树林地的概况

该母树林是人工红松母树林，建于1966年，位于柳毛河林场20、22、24、26林班，面积为230hm2，林分类型为针叶混交林。主要树种有：红松、云杉、樟子松。目的树种平均年龄47年，平均胸径18cm，平均高7m，平均冠幅3m，结实良好。

1.3红松母树种子管理

红松母树种子由于价值高，市场需求大，如果管理不当，其采集、存储、加工、销售等环节较难控制。随着森林分类经营和红松母树承包经营合同化管理的实施，红松种子必须由营林部门统一收购，留足育苗生产用种，剩余的红松种子方可作为商品种子出售。

2.红松母树林承包经营管理效益分析

2.1经济效益

红松种子生产的经济效益主要表现在商品种子上，通过试验标定，由于不同等级的红松种子的出仁率差异显著，因此加工不同等级的红松种子生产种仁的经济效益也非常显著。一等种子生产1kg红松种仁，利润为27元；二等种子生产1kg红松种仁，利润为7元；三等种子生产1kg红松种仁，利润为3元。每万kg一、二、三等种子生产种仁的利润分别为89100、17500、6000元。全局可采种红松林3450hm2，全部承包到位，杜绝抢采掠青，经济效益是非常可观的。

2.2社会效益

2.2.1杜绝了抢采掠青现象

由于红松种子价格上涨，由10年前20元/kg涨到80元/kg以上。在高额利润的诱惑下，难免会出现掠夺红松球果的现象。2002年柳毛河林场合理地把红松母树全部承包给采种者。同时，由林场汇同承包者组成了一个强大的看护队，使红松母树种子得到有效保护，保证对红松母树种子的需要。

2.2.2有利于种子收购，减少种子外流

红松母树承包合同规定了承包者的任务，同时，承包人向场方交纳保证金。交给承包人采种权利的同时，也规定了他们交种的义务。所以，采种者交售种子热情高，2002年红松种子计划收购1.5万斤，实际完成种子收购1.7万斤，完成计划的113%，其中1.2万斤来源于红松母树林，占完成数量的71%。

2.2.3保证种子质量

通过随机抽样检验，承包单位采集的红松种子的净度、千粒重、优良度都高于非承包单位。承包单位采种的千粒重和优良度分别是非承包单位采种的132%和160%，说明红松母树承包经营势在必行，也只有实行红松母树承包经营，才能逐步实现采种基地化，种子质量标准化，育苗良种化。

2.2.4减少种源浪费，提高采种者的收入

承包前每年8月初人们就开始抢采掠青红松球果，由于种子尚未成熟，含水量高，天气炎热，空气湿度大，采摘的青果易腐烂变质，白白扔掉，浪费严重。即使没有腐烂的青果，调制出的种子也只有半仁，种子质量低劣，浪费了种源和人力。实行红松母树林承包后，杜绝了掠青，种子抽样检验净度98%，优良度80%。2002年红松种子仅是一个平年，承包者采种平均收入达30，000元。职工收入的增加对安定团结，促进林区经济发展和社会的进步起到很大的作用。

2.3生态效益

红松母树实行承包经营合同化管理后，使红松母树得到较好保护。往年秋季采种，林内树头、枝桠遍地可见。柳毛河河林场实行红松母树承包后，通过近4年的林地调查无一株母树受损。杜绝了往年采种砍枝桠、砍树头的现象。红松母树得到保护，母树的冠幅逐年增大，从而增加了林冠对雨水的截留量，改善了林下土壤的水份状况和涵养水源的作用。林冠使透过的降水强度降低，雨水冲击地面的力量减弱，对防止水土流失具有很重要的作用[3]。

3.结论

综上所述，红松母树应采取的经营管理模式是：承包经营合同化管理。由此，红松母树得到很好地保护，杜绝了抢采掠青红松种子现象，保证了种子质量，有利于种子收购，减少种子外流，减少种源浪费，提高采种者收入，经济效益可观。所以，应加大红松母树承包经营合同化管理的面积，并扩展以达到结实年龄的散生天然红松母树等[4]。

实行森林分类经营，红松种子必须由营林部门统一收购。种子部门应由单一的种子生产向种子加工业方向发展，充分发挥红松种子生产自身的经济价值，服务于林业经济是今后的发展方向。■

【参考文献】

[1]胡家强.论土地承包经营权合同与土地承包经营权[J].改革与战略，2008，（6）.

[2]尉立铭，王兴国，董观岩.红松母树林经营管理技术的探讨[J].林区教学，2007，（1）.