合成纤维(6篇)
合成纤维篇1
[关键词]地塞米松；碱性成纤维细胞生长因子；皮瓣；缺血坏死；成活率；TNF-α；ICAM-1
[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2010）04-0591-04
ExperimentalstudyoftheapplicationthatDexamethasonecombinedwithbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)topreventischemiaandnecrosisfromultra-longradomskinflap
LINJie,QIUShu-lin
(DepartmentofPlasticSurgery,HebeiPeople’SHospital,Shijiazhuang050051,Hebei,China)
Abstract:ObjectiveTostudythecombinedeffectsofDexamethasoneandbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)oftherandomflapsurvivalonrat'sdorsal,andfurtherexplorethelevelsofTNF-αinserumandhowisthemechanismthattheintercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)inendothelialcellsofskinflaptoplayarole.MethodsTheratdorsalskinflapmodel,aone-timeimmediatelyafterhigh-doseintraperitonealinjectionofDexamethasone,dripbFGFequablyundertheflap,observedthechangesofTNF-αandICAM-1within24h,post7daysviewthesurvivalrateoftheflapandhistologicalchanges.ResultsThesurvivalrateofflapcombinedgroup(58.2±5.2)%>bFGFgroup(50.5±3.9)%>Dexamethasonegroup(48.7±4.2)%>thecontrolgroup(39.5±3.7)%,(F=32.08,P
Keywords:Dexamethasone;basicfibroblastgrowthfactor(bFGF);flap;ischemiaandnecrosis;survivalrate;TNF-α；ICAM-1
皮瓣缺血坏死是一种复杂的病理生理过程。伴随随意型皮瓣形成，皮瓣边缘及基底部血供完全离断，仅保留蒂部的血液供应，直接导致血管损伤，血小板聚集，皮瓣组织缺血、缺氧，同时发生白细胞粘附、游走，炎性因子释放，氧自由基损害和钙离子超载等病理变化，而炎症的发生又进一步加重了皮瓣组织损伤。超长随意型皮瓣由于超过了随意型皮瓣长宽比例的最高限度（2:1），蒂部血液供应不能达到皮瓣远段，使得皮瓣远段组织长时间的缺血缺氧情况未得到改善，故其最终的结果是皮瓣远段发生坏死。因此，皮瓣坏死防治的根本措施在于改善血液循环，减轻炎症反应和防止或减轻缺血再灌注损伤。本研究试图通过观察应用地塞米松及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后大鼠皮瓣成活率、组织学等的变化，同时测定血清中TNF-α含量、皮瓣中ICAM-1含量，进一步了解联合应用地塞米松及bFGF提高皮瓣成活率的可行性，以扩大任意皮瓣移植的应用范围。
1材料和方法
1.1动物来源及分组：健康Wistar大鼠（河北医科大学动物实验中心提供，体重280g±10g）96只，雌雄不限。大鼠背部超长任意皮瓣模型制备后，按术后即刻给药不同，将大鼠随机分为四组，即A组为对照组：腹腔注射生理盐水0.2ml，皮瓣下滴注生理盐水0.25ml；B组为地塞米松组：腹腔注射地塞米松0.2ml（用量为5mg/kg），皮瓣下滴注生理盐水0.25ml；C组为bFGF组：腹腔注射生理盐水0.2ml，皮瓣下滴注含1750IUbFGF的生理盐水0.25ml（用量为155IU/cm2）；D组为地塞米松联合bFGF组：腹腔注射地塞米松0.2ml，皮瓣下滴注含1750IUbFGF的生理盐水0.25ml。
1.2大鼠背部超长任意皮瓣模型制备：96只大鼠均以2%戊巴比妥钠腹腔注射（35～40mg/kg）麻醉，麻醉满意后，背部脱毛，俯卧位固定，碘酒、酒精消毒。于鼠背正中以髂嵴连线为基准线，以后正中线为轴线，掀起一7.5cm×1.5cm大小的任意皮瓣（含脂膜肌层，长宽比5:1），其蒂在尾部。3-0丝线原位缝合皮瓣，B、D组术后即刻一次性腹腔注射地塞米松，C、D组术后即刻于皮瓣下均匀滴注bFGF。A组给予生理盐水腹腔注射及皮瓣下滴注，时间方法同上。
1.3观测指标及方法：①皮瓣大体观察：术后第7天对大鼠背部随意皮瓣成活的情况进行肉眼观察；②皮瓣成活率：坏死皮瓣以其外观、颜色及质地来判断,术后7天，用数码相机进行皮瓣摄像，图像输入计算机，应用Image-ProPlus.v6.0图像分析系统，计算出皮瓣成活率（即皮瓣成活面积与总面积之比）；③组织学检查：术后3天和7天各组均于皮瓣中段取0.5cm×0.2cm全厚皮瓣组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、HE染色；a)光镜下观察组织结构改变；b)进行毛细血管计数，血管计数方法：所有血管均计数在内，每组5张切片，每张切片在中央区及周边区随机选取5个高倍视野，血管计数后求其平均数；c)进行成纤维细胞计数：每组5张切片，每张切片在中央区及周边区随机选取5个高倍视野，成纤维细胞计数后求其平均数；④检测血清中TNF-α含量：各组分别于术后0h、1h、4h、8h、12h、24h心脏取血，离心后取血清，用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α含量；⑤细胞间粘附分子1（ICAM-1）免疫组化染色切片：术后4h、8h、12h各组均于皮瓣中段取0.5cm×0.2cm全厚皮瓣组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，免疫组化染色，光镜观察ICAM-1的分布部位和表达；每张切片选取有代表性的区域，随机取5个互不重叠的400倍视野，以光密度200为背底，光镜显微照相机取图，应用Image-ProPlus.v6.0图像分析系统进行定量分析，测量阳性目标累积光密度值（integratedopticaldensity，IOD）,并用计算机进行统计学处理；⑥统计学处理：整理各类数据并应用SPSS13.0软件对数据进行处理。
2实验结果
2.1皮瓣大体观察：术后7天，D组皮瓣近段颜色淡红，弹性好，并可见少量毛发生长；中段中间区颜色由近向远淡红色逐渐变暗，表面无痂壳形成，无毛发生长，边缘区颜色发黑并有少量痂壳覆盖，弹性减退；远段颜色发黑，表面有痂壳，弹性差。原位掀起皮瓣时见皮瓣出血活跃，出血量较多；肉膜下无积血积液，血管丰富。C组：皮瓣表面肉眼观与地塞米松组近似，皮肤弹性略好于地塞米松组，原位掀起皮瓣时可见肉膜下较薄一层淡红色新鲜肉芽组织，出血活跃，出血量较多，亦可见少量炎性渗出液。B组：皮瓣近段颜色淡红，弹性较好，少见毛发生长；中段颜色逐渐变暗，表面有部分黑色痂壳形成，无毛发生长，弹性较差；远段颜色发黑，痂壳较厚，弹性极差。原位掀起皮瓣时见肉膜下可见少量新鲜出血及少量渗出液。A组：皮瓣近段颜色淡红，由近向远颜色变暗，皮瓣蒂部可见少量毛发生长；中段及远段颜色发黑，表面有痂壳形成，弹性极差，原位掀起皮瓣时见皮瓣出血较少，肉膜下炎性分泌物较多，血管相对稀疏。根据观察结果，各实验组皮瓣中远段成活情况均明显好于A组；D组皮瓣中远段成活情况略好于C组和B组。
2.2皮瓣成活率：术后7天皮瓣成活率，D组C组B组A组，四组有非常显著性差异（F=32.08，P0.01）。两两比较，B、C组间无显著性差异（P0.05），其他各组间均有显著性差异（P0.01）。（见表1）
2.3HE染色光镜组织学观察
2.3.1术后3天，D组：表皮及真皮各层结构无明显改变，皮下组织轻度水肿，血管扩张、充血，无明显嗜中性粒细胞浸润，成纤维细胞增生，肌纤维排列规则、紧密；C组：表皮及真皮细胞排列较规则，皮下组织水肿，血管扩张、充血明显，可见嗜中性粒细胞浸润，成纤维细胞大量增生，肌纤维排列较规则、结构紧密；B组：表皮及真皮细胞排列较规则，皮下组织水肿，血管扩张、充血，可见少量嗜中性粒细胞浸润，肌纤维排列较规则、结构松散；A组：局限性表皮变薄，皮下组织水肿较重，血管扩张、充血，可见嗜中性粒细胞浸润，肌纤维排列紊乱、结构松散。术后7天，D组：表皮萎缩不明显，皮肤各层结构无明显改变，复层上皮细胞排列整齐；皮下组织轻度水肿，血管轻度扩张；可见散在的局灶性嗜中性粒细胞浸润；真皮和真皮下层新生小血管生长活跃，皮下纤维组织增生明显，纤维排列较规则。C组：局限性表皮萎缩、变薄、破溃；皮下组织水肿，血管扩张，有少许皮下出血；嗜中性粒细胞浸润明显；真皮和真皮下层可见新生小血管，皮下纤维组织增生，纤维排列较规则。B组：表皮破损，真皮层细胞排列较紊乱；皮下组织水肿，血管扩张，并有散在皮下出血；有明显的嗜中性粒细胞浸润；真皮和真皮下层可见少量新生小血管，肌组织松散，纤维排列较规则。A组：表皮及真皮完全坏死；结构混乱不清；大量的嗜中性粒细胞浸润；肌纤维坏死明显。
2.3.2毛细血管计数：术后3天，D组（7.4±0.55）个C组（6.8±1.09）个B组（4.6±0.55）个A组（3.2±0.84）个，四组有非常显著性差异（F=32.40，P0.01）。两两比较，D、C组间无显著性差异（P0.05），其他各组间均有显著性差异（P0.01）。术后7天，D组（7.0±0.71）个C组（3.8±1.09）个B组（2.6±0.55）个A组（0.4±0.55）个，四组有非常显著性差异（F=65.94，P0.01）。两两比较各组间均有显著性差异，其中B、C组间比较P0.05，其他各组间比较P0.01。
2.3.3成纤维细胞计数：术后3天，D组（27.8±3.56）个C组（26.4±3.21）个B组（11.8±2.86）个A组（11.2±2.39）个，四组有非常显著性差异（F=44.18，P0.01）。两两比较，D、C组成纤维细胞数量明显多于B、A组，差异显著（P0.01）；D、C组间比较，B、A组间比较，均无显著性差异（P0.05）。术后7天，D组（48.2±7.33）个C组（23.6±4.45）个B组（15.0±1.87）个A组（0.6±0.89）个，四组有非常显著性差异（F=102.47，P0.01）。且两两比较各组间有显著性差异（P0.01）。
2.4血清中TNF-α含量：术后0h、1h、4h、8h、12h、24h血清中TNF-α含量统计结果（图1）显示，A、C组于术后4hTNF-α的浓度达到高峰，然后逐渐下降，于术后24h下降明显；B、D组，于术后8hTNF-α的浓度达到高峰，亦于术后24h下降明显。各组峰值统计结果显示，B、D组明显低于A、C组，差异显著P0.01。
2.5ICAM-1在皮瓣中表达的免疫组织化学变化：术后4h，A、C组皮瓣组织的上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的胞浆中均呈现阳性表达,且表达量较多，呈散在性分布；B、D组在上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞胞浆中的表达呈弱阳性，表达量很少，呈散在性局灶性分布。术后8h，各组均呈现ICAM-1阳性蛋白表达高峰，A、C组皮瓣上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的胞浆中呈强阳性表达，可见大量棕褐色阳性颗粒分布，B、D组阳性表达也明显增强，染色呈棕黄色，散在分布。术后12h，各组表达均有所下降，其中B、D组下降明显，但尚未恢复至术后4h水平，A、C组随较术后8h表达有所下降，但仍保持较高水平。术后4h、8h、12h测量ICAM-1阳性目标累积光密度值统计结果（图2）显示，术后8h，各组均呈现ICAM-1阳性蛋白表达高峰，四组峰值有非常显著性差异（F=224.30，P0.01），两两比较，A、C组明显高于B、D组（P0.01）。
3讨论
皮瓣在缺血坏死过程中活化大量的中性粒细胞，活化过程中产生大量氧自由基，Ca2+超载，并分泌大量炎性细胞因子如：TNF-α、IL-1、IL-8等，造成内皮细胞破坏，中性粒细胞活化后还会经历与内皮细胞粘附，浸润到组织，中性粒细胞与内皮细胞的粘附可引起血管的持续性收缩，引起组织的低灌注，这也是造成缺血-再灌注损伤的原因，最终导致死亡。而粘附始于内皮细胞的细胞间粘附分子1（ICAM-1）与白细胞受体的结合。本研究免疫组化染色结果证实：应用地塞米松能够抑制上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞胞浆中ICAM-1阳性蛋白的表达，有效的抑制了ICAM-1与白细胞受体的结合，从而减少中性粒细胞与内皮细胞的粘附，减轻皮瓣炎症反应。本实验中另一结果显示：地塞米松可以抑制中性粒细胞活化过程释放炎性细胞因子TNF-α，从而减轻皮瓣的炎症反应。术后即刻起手术应激导致血液中TNF-α浓度增高，随后逐渐增高，应用地塞米松可以延迟其峰值浓度出现时间，并有效降低其峰值，随后血清中TNF-α浓度下降，各组均于术后24h明显下降，且低于术后即刻水平。这提示我们临床应用地塞米松应愈早愈好，本实验进一步证实了地塞米松给药时间的选择应在TNF-α高峰出现前抑制其释放，即术后4h前尽早给药可以达到最佳效果。本实验于术后即刻一次性大剂量（5mg/kg）给予地塞米松腹腔注射可以有效减轻皮瓣炎症反应又避免了糖皮质激素副作用的发生。
缺血皮瓣与受床及伤口边缘组织间微循环重建直接影响缺血组织的存活。bFGF是一种广谱的有丝分裂原，具有广泛的细胞增殖效应。动物实验发现它能促进各种组织和器官内的血管再生，可显著增强内皮细胞粘附迁移、分裂增殖，促进血管新生，加速创伤愈合[1-3],也促进组织细胞本身的分裂增殖，诱导周围毛细血管向其内部的长入，尤其能促进内皮细胞分裂，这种作用可能通过上调VEGF(血管内皮生长因子)表达，诱导其分泌某些蛋白酸,溶解并侵入周围基质,进而形成毛细血管[4-6]。这种促血管生成作用有可能使皮瓣在移植后较早期与受体建立血管网。本实验结果也证实了bFGF有促进随意皮瓣成活的作用，光镜病理组织观察结果显示：应用bFGF组真皮及真皮下组织新生小血管生长活跃，皮下肌纤维组织增生明显，结构排列整齐。且联合应用地塞米松及bFGF组毛细血管数和成纤维细胞数均显著多于bFGF组（P0.01），表明地塞米松能够增强bFGF的促血管内皮细胞和成纤维细胞生成作用。
本实验研究根据两种药物促进皮瓣成活机理不同，将地塞米松与bFGF两种
药物联合应用促进皮瓣成活的效果更佳。其发挥协同作用的机理仍有待进一步研究。
[参考文献]
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合成纤维篇2
[论文关键词]血管紧张素Ⅱ；逆转录聚合酶链反应；增生性瘢痕；成纤维细胞；纤维连接蛋白
[论文摘要]目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其Ⅰ型、Ⅱ型受体阻断剂和钙调神经磷酸激酶(CaN)的阻滞剂环胞素A(CsA)对增生性瘢痕来源的成纤维细胞纤维连接蛋白mRNA和蛋白表达的作用。方法：体外分离培养增生性瘢痕成纤维细胞，分别将一定浓度的AngⅡ(10-9-10-5l/L)，和AngⅡ10-6mmol/L加上不同阻滞剂losartan、PD123319、环胞素A(浓度均为10-5mmol/L)加入细胞培养液中刺激48h，分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot印迹方法检测增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表达。结果：体外成功地培养增生性瘢痕成纤维细胞。经AngⅡ刺激48h后，FNmRNA和蛋白表达量明显增高，增高程度与AngII浓度呈正比；加入losaartan和环胞素A后，FN原mRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组下降，而加入PD123319后，FNmRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组无明显改变。结论：AngⅡ可促增生性瘢痕成纤维细胞的FN合成，可能在增生性瘢痕的发展过程中起重要作用，该作用主要通过AngⅡ的Ⅰ型受体介导完成，该作用可能与CaN信号通路有关。
增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子，其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。近来研究认为，AngⅡ作为一种生长因子，是一种强烈的促有丝分裂原，在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)为一种大分子非胶原糖蛋白，是细胞外基质的重要成分。本研究通过体外实验，观察AngⅡ及其受体拮抗剂、CsA对成纤维细胞合成FN的影响。
1材料和方法
1．1主要试剂：AngⅡ(美国Anaspec)；Losartan、PDl23319、csA(美国sigma)；大鼠抗人FN抗体(美国Neomarkers)；兔抗大鼠IgG(北京中杉)；DMFM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Hyclone)；医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ-875型)；CO2培养箱(美国SHEL—LABl815TC型)。
1．2取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗；②病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病；③病人无全身感染、肿瘤；④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未进行过全身应用皮质类固醇等药物治疗。
1．3成纤维细胞分离、培养：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6-8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3-4天换液1次，2-3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，此后每2-3天换液1次，每4～5天分种传代1次，实验用第3-5代细胞。
1．4实验分组：实验分为四组：①对照组：10％胎牛血清的DMEM培养液；②AngⅡ组：培养液中加入AngⅡ，浓度范围(10-9mol/L-10-5mol/L)；③AngⅡ+洛沙坦(losartan)组：培养液中同时加入AngⅡ(10-6mol/L)合losartan(10-5mol/L)；④AngⅡ+PDl23319组：培养液中同时加入AngⅡ(10-6mol/L)和PDl23319(10-5mol/L)；⑤AngⅡ+CsA组培养液中同时加入AngⅡ(10-6mol/L)合CsA(10-5mol/L)。
1．5逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FN的mRNA的表达：选取生长较好的成纤维细胞，采用Trizol法提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和纯度，-80℃保存。按照试剂盒操作说明，根据FN的相应基因序列合成引物，逆转录为cDNA，PCR法扩增。FN的引物设计：上游引物序列：5’-GATGTGATGTCGATTCCAT一3’下游引物序列：5’-GATCTCTGGTCCATGAAGAT-3’，扩增片段为1107bp。内参照β-actin引物上游序列5’-GTTGCGTTACACCCTTTCTTGACA-3’，下游序列为：5’-GCACGAAGGCTCATCATTCAAAA-3’，产物446bp。引物由北京华大基因合成。RT-PCR反应条件：94℃预变性3min，然后进入30个循环：94℃lmin，57℃退火lmin，72℃lmin。循环完毕，72℃延伸7min。1.5％琼脂糖胶上电泳，紫外灯下观察结果并摄像。用凝胶图像分析系统对目的基因的PCR产物进行灰度测定，采用4.1版本QuantityOne软件(Bio-Rad)分析各条带光密度值与内参片段的面积灰度比值，基因表达量以该比值来表示。
1．6Westernblot检测FN蛋白表达：细胞用SDS溶液裂解后，离心取上清。蛋白浓度采用BCA法测定。取50μg蛋白，经SDS-PAGE(12％分离胶，4％积层胶)分离后，采用半干电转方法将蛋白转移到PVDF膜上。用含有5％BSA的TBST封闭后，加入1:500稀释的抗AT1、AT2抗体和抗β-actin抗体于室温下孵育2h，随后加入1:300稀释的二抗于室温孵育1h，最后加入ECL试剂显影。采用4.1版本OuantityOne软件(Bio-Rad)分析各条带光密度值，β-actin蛋白表达作为内参照。
1．7统计学处理：SPSS10.0统计学软件分析。数据以(x±s)表示，进行t检验、相关分析及多个实验组与同一对照组的比较的方差分析，P＜0.05有统计学意义。
2结果
2．1不同浓度AngⅡ作用于成纤维细胞后FN的mRNA表达结果：总RNA在260和280nm波长下的吸光度比值大于1.8。甲醛变性提示mRNA表达完整，可用于半定量分析。AngII浓度为10-8mol/L时，FN的mRNA表达量开始增加，随着AngⅡ加入浓度的提高，成纤维细胞FN的mRNA表达也随之增加，与对照组差异显著。
2．2不同干扰因素与AnaⅡ共同作用于成纤维细胞后FN的mRNA表达结果：加用losartan后，成纤维细胞FN的mRNA表达较单用AngⅡ组表达下降，与对照组接近，加用CsA后，AngⅡmRNA表达也下降，但表达仍然高于对照组，加入PDl23319后对结果没有影响。
2．3不同浓度AngⅡ作用于成纤维细胞后FN的蛋白表达结果：AngⅡ浓度为10-8mol/L时，FN蛋白的表达量开始增加，随着AngⅡ加入浓度的提高成纤维细胞FN的蛋白表达也随之增加，与对照组差异显著。
2．4不同干扰因素与AngⅡ共同作用于成纤维细胞后FN的蛋白表达结果：加用losartan后，成纤维细胞FN的表达较单用AngⅡ组表达下降，与对照组接近，加用CsA后，AngⅡmRNA表达也下降，但表达仍然高于对照组，但加入PD123319对结果没有影响。
3讨论
FN是炎症条件下由成纤维细胞等分泌产生的细胞外基质成分，具有多种生物学功能，对介导细胞增殖和其他其他外基质成分的沉积以及在伤口愈合过程中起重要作用。有关文献报道，皮肤损伤后，伤口处沉积大量FN，诱导成纤维细胞、上皮细胞向伤口移动，并促进其增殖。此时的成纤维细胞、肌成纤维细胞和真皮内都含有丰富的FN。一旦上皮细胞再生完成、新生血管形成，成纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞的FN随即消失。肉芽组织瘢痕化过程中，纤维化明显形成前组织中FN开始增多，当胶原增多、沉积形成紧密的束壮排列时，FN减少或消失。
肾素一血管紧张素系统(RAN)是机体调节血管张力和水钠代谢的内分泌系统的组成部分，随血液循环发挥作用。血管紧张素Ⅱ是RAS系统的主要活性成分。循环中的AngⅡ主要来自肝脏，但研究发现局部组织也可自身合成分泌AngⅡ。Stecklings等利用RT-PCR技术检测到血管紧张素原的mRNA在体外培养的原代角质形成细胞、黑素细胞、真皮成纤维细胞和真皮微血管内皮细胞上都有表达。Phillips等通过实验也得到相似的结果。AngⅡ受体主要分为AT1、AT2两种亚型，AT1受体是一种膜受体，它具有激素受体的所有特征。它介导血管紧张素Ⅱ受体的大部分生理功能。Stecklings等通过RT-PCR检测出皮肤角质细胞、黑素细胞、真皮成纤维细胞及微血管内皮细胞均能表达AT1和AT2的mRNA。
目前，以AngⅡ为主要因子的RAS在一些组织器官的纤维化过程中的重要作用正逐渐引起越来越多学者的关注。在纤维化过程中，局部组织的RAS激活，包括AngⅡ在内的一些因子表达水平升高，表明局部RAS可能参与了组织器官纤维化和/或结构重构过程。这样的器官包括肝脏、肾脏、心脏、肺和皮肤。ACE抑制剂、AngⅡ受体拮抗剂和阻断剂等可通过不同方式延缓和/或抑制器官纤维化的发生，进一步说明AngⅡ有促器官纤维化的作用。增生性瘢痕是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理表现，其机制目前还不清楚。在皮肤组织中成纤维细胞占全部细胞数的40％-60％，是重要的修复细胞。成纤维细胞大量合成细胞外基质创伤修复中主要活动之一。已证明皮肤是AngⅡ的靶器官之一，AngⅡ能促进皮肤成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积，提示AngⅡ在人类瘢痕形成可能具有独特的作用。
合成纤维篇3
【关键词】糖尿病;愈合;创面;成纤维细胞
随着世界各国社会经济的发展，居民生活水平的提高，由于饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率及患病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。糖尿病患者皮肤易受损伤，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡。糖尿病以其高发病率和多并发症的特点正日益成为人们研究的热点。因此，糖尿病溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合的研究也日趋深入，成纤维细胞在创面愈合中起重要作用，本文就糖尿病创面愈合中糖尿病对成纤维细胞的影响以及成纤维细胞的改变作一综述，以期了解成纤维细胞在糖尿病创面愈合中与正常创面愈合中的不同，并且为相关基础研究和临床治疗提供提导。
1成纤维细胞在创面愈合中的作用
创面愈合过程是一个复杂的过程，需要多种因素的共同参与，其过程包括炎症期，增生期和重塑期3个阶段。成纤维细胞是创面修复过程中的最主要的功能细胞。在伤口愈合过程中经过迁移、增殖，分泌大量的胶原纤维和基质成份，与新生毛细血管等共同构成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。肉芽组织填充是创面愈合中的关键步骤，一般经过成纤维细胞激活，迁移，增殖及分泌细胞外基质等过程。其中成纤维细胞增殖分化是最重要的细胞活动之一。Richard等[1]认为在皮肤损伤修复过成中，成纤维细胞经过4个表型表化过程。伤后前3天成纤维细胞大量增殖分化，第4天迁移到伤口内，合成并分泌大量细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)及生长因子;第7天成纤维细胞开始表现为收缩表型(终末表型)-肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)，导致创面收缩。在组织修复中后期，成纤维细胞开始出现凋亡，因此认为成纤维细胞参与了整个创面修复过程。
2糖尿病对成纤维细胞的影响及成纤维细胞的改变
糖尿病创面愈合的研究也日趋深入，我们就这以下几方面探讨糖尿病时各种方面的异常对成纤维细胞的影响以及成纤维细胞的改变。
2.1糖尿病时信号转导通路异常对成纤维细胞的影响及其改变创面的愈合需要多种细胞、细胞因子和细胞外基质等因素的共同参与。糖尿病难愈创面修复过程存在一个极其复杂的信号网络调控机制，涉及组织、细胞、分子、基因等多个层面，任何一个环节的失控将会导致自身调节的失控。其中转化生长因子β(TGF-β)与smad信号通路的改变可影响成纤维细胞，TGF-β有β1～β5五个亚型，哺乳动物体内，TGF-β1-3是主要的三种，其中又以TGF-β1占大多数。smad蛋白家族是把TGF-β与其受体结合后产生的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，各类smad蛋白相互联系制约，并通过不同途径参与TGF-β的信号转导。TGF-β1可以促进成纤维细胞的迁移、增殖，强烈趋化成纤维细胞和炎性细胞，抑制上皮细胞生长但加速血管形成，可以通过刺激成纤维细胞合成胶原等细胞外基质、抑制基质蛋白酶活性并增强胶原酶抑制剂的表达来调节ECM蛋白的表达，在创面愈合的早期TGF-β1即被释放，伤后5～7d呈现第二个高峰。伤口愈合过程中内源性Smad3的表达、激活与炎症反应的启动、结束及胶原合成密切相关。糖尿病患者溃疡区TGF-β1正常的伤后上调反应缺失，而TGF-β3却表达上调，可以部分地解释其慢性难愈创面的特点;Chesnoy等[2]通过糖尿病小鼠创面皮内注射质粒DNA来转染TGF-β1基因发现：创面的细胞增殖率和细胞外新生基质的密度、有序性排列比对照组明显提高，且愈合时间可提前约50%。
2.2糖尿病时创面愈合调控的神经因素异常对成纤维细胞的影响及其改变实验研究表明，神经因素亦参与创面愈合调控的过程。正常皮肤中可表达各种类型的神经肽(neuropeptides)，这些神经肽包括P物质(sP)、生长抑素、神经肽Y(NPY)等等，参与皮肤的诸多生理功能(如代谢、免疫等)和病理变化(最重要的即创伤愈合)。糖尿病皮肤创缘P物质浓度远低于正常水平。目前研究发现，在糖尿病大鼠背部皮肤创伤模型上观察到外源性sP可以明显加速糖尿病难愈伤口愈合，提高愈合质量[3，4]。Nilsson等证实P物质对培养的人皮肤成纤维细胞、动脉平滑肌细胞有刺激作用，可促进这些细胞的DNA合成[5]。
2.3糖尿病时糖基化终末产物的异常对成纤维细胞的影响及其改变晚期糖基化终末产物(AGEs)一直是近年来糖尿病及其各类并发症的研究热点，在影响创面愈合方面取得了一定的进展。非酶促糖基化与血糖持续升高有密切关系，在正常衰老过程中也会进行，但在某些病理状态(如糖尿病)下糖基化反应明显加速，引起AGEs的蓄积。AGEs在局部皮肤过量沉积后，可能通过直接作用(糖基化细胞外基质和有关生长因子如bFGF)和受体途径等引起组织、细胞功能的紊乱[6]。糖基化修饰后的碱性成纤维细胞生长因子促有丝分裂的活性明显降低，而且，AGEs还能抑制成纤维细胞合成胶原的能力[7]。成纤维细胞是创面愈合过程中的主要修复细胞，膜表面存在多种AGEs结合蛋白，AGEs还可抑制其细胞增殖，并可以诱导其凋亡，而且与作用时间及含量相关[8]。RAGE是最具代表性的AGEs特异性受体之一。在糖尿病患者体内成纤维细胞膜上有持续高表达，AGEs受体的表达的增强可引起持续的成纤维细胞损伤和功能损害[9，10]。牛轶雯等通过建立糖基化细胞外基质的体外模型，证实糖基化细胞外基质对成纤维细胞的损害作用[11]。
2.4糖尿病时细胞凋亡的改变对成纤维细胞的影响及其改变细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，它是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老或受伤的细胞，保持机体内环境平衡的一种自我调节机制。细胞凋亡存在于创面愈合的每个阶段，随着研究的深入逐渐成为研究的新方向和热点。文献报道，在创面愈合过程中，生长因子减少或消失的直接作用，可诱发生长因子依赖的肌成纤维发生凋亡[12]。
2.5DM时MMPs家族动态平衡异常对成纤维细胞的影响及其改变创伤愈合是个复杂而有序的生物学过程，细胞移行、肉芽组织的形成、新生血管化以及基质的重塑均有赖于细胞外基质(extracellularmatrix.ECM)的可控性代谢。ECM的过度沉积或降解将致创面修复异常。基质金属蛋白酶(matrixmetaltoproteinases，MMPs)是一类具有共同生化性质的可降解ECM的锌依赖性肽链内切酶，是参与ECM降解的主要蛋白酶之一。MMPs还具有重要的病理意义，当MMPs表达增多和酶活性增强可导致细胞外基质的过度降解，表现为慢性难愈创面。Wall等[13]对糖尿病患者未受损皮肤的观察也提示糖尿病未受损真皮成纤维细胞中MMP-2，MMP-3增高。在体外比较糖尿病鼠和正常鼠的成纤维细胞，糖尿病鼠的成纤维细胞迁移能力下降75%，VEGF减少7倍，而前MMP-9增加2倍[14]。
2.6糖尿病时的高糖对成纤维细胞的影响及其改变文献报道高糖在短时间对成纤维细胞的增殖能力增强，但长时间则起抑制作用[15]。在高糖和AGE-人血清白蛋白干预下，真皮成纤维细胞的生长抑制和凋亡细胞百分率显著高于正常对照，且生长抑制和凋亡率呈AGE的剂量依赖性。真皮成纤维细胞的真皮增殖细胞核内抗原表达上升，但增殖周期显示处于S期细胞比例升高而G2/M期细胞却未相应增加[16]。
3小结与展望
随着分子生物学、遗传学和免疫学等实验技术手段的不断提高与成熟，糖尿病对成纤维细胞的影响及其改变的认识会越来越深刻。这些领域的研究进展为研究成纤维细胞在治疗糖尿病难愈性创面提供了更广阔的思路和方法，我们可以期待在不久的未来，临床糖尿病难愈性创面的治疗必将会翻开新的篇章，取得更大的进步。
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合成纤维篇4
【关键词】MRI腕关节镜；三角纤维软骨复合体脂肪抑制扰相梯度回波（FS-SPGR）
1.TFCC的组成及其周围韧带走形特点
目前国内外一致认为腕尺侧痛的产生与三角纤维软骨复合体损伤有关，但对TFCC的解剖和走形尚存在争议[1]。TFCC起自桡骨远端月骨窝掌面的尺侧缘向尺侧走行，止于尺骨头凹和尺骨茎突基底后继续向远端延伸，最后止于三角骨、钩骨和第五掌骨底。TFCC由腕三角纤维软骨（trianguiarfibrocartilage，TFC）及其周围韧带组成[2，3]，Palmer和Wemer[4]将TFC、尺侧副韧带、桡尺远端掌背侧韧带、尺三角韧带、尺月韧带和尺侧腕伸肌腱鞘、关节盘同系物统称为TFCC。
TFCC走形特点：关节盘同系物：黄继锋[2]等认为关节盘同系物是桡尺远侧韧带浅部尺侧面与尺侧囊之间的组织。Ishii[5]等研究发现关节盘同系物和囊状隐窝（茎突前隐窝）有3个类型：窄开口型，宽开口型，闭口型。
桡尺远侧韧带：三角纤维软骨掌、背侧缘增厚移行为桡尺远侧韧带，桡尺远侧韧带的浅、深两部分在桡骨上的附着处是融合在一起的。在乙状切迹与尺骨茎突之间的中部浅、深韧带分开，浅韧带继续向尺远侧走行，达尺侧囊，深韧带向近侧走行至尺骨茎突基底部。桡尺远侧掌、背侧韧带的深部纤维均止于尺骨茎突陷窝。
尺侧腕伸肌腱鞘：尺侧腕伸肌腱鞘位于尺侧囊结构的后外侧，较尺侧囊组织致密，其底部与关节盘的背外侧面密切联合。当腕关节屈伸活动时，尺侧腕伸肌腱鞘随关节盘一起活动。
尺侧囊结构：尺侧囊结构，Taleisnik[6]和于胜吉[7]认为此并非真正韧带，而是关节囊增厚，故称其为关节囊结构，也有学者称为尺侧副韧带。起于尺骨茎突的基底部，纤维向下与关节盘尖部的纤维交错混合，止于三角骨的背尺侧面。它较为薄弱，为增厚的结缔组织形成，无明显的韧带结构。
尺三角韧带：此韧带较为薄弱，起于尺骨茎突基底的桡侧面及关节盘掌侧缘的尺侧，垂直下行止于三角骨的掌面。从腕尺间隙观察，尺三角韧带主要起于关节盘同系物的掌侧，部分纤维起于三角纤维软骨的掌侧缘，止于尺月韧带的掌侧。
桡尺三角韧带：恰位于指伸肌腱之底，并与其有部份附着，纤维起自桡骨背侧近尺侧缘及关节盘背侧缘桡侧半，斜行越过月骨背面，止于三角骨近端，此韧带较为坚韧。
尺月韧带：也称为短桡月韧带，此韧带强韧，是稳定月骨的重要结构。起自桡骨远端月骨窝的掌侧面和关节盘的桡掌侧缘，止于月骨尺侧半的掌面和月三角骨间韧带，它与远侧桡尺掌侧韧带缠绕一起。此韧带扁宽，伸展性小和关节盘紧密相贴。
2.腕关节镜诊治现状
1972年既有对三角纤维软骨复合体损伤的描述，但一直未引起临床的重视。Roth于1988年首次报告用关节镜技术行TFCC有限的清创，对TFCC无血管区域做撕裂扩大术而保持背侧桡尺韧带和掌侧桡尺韧带的完整性和生物力学上的稳定性。1989年Palmer根据TFCC损伤的病因和部位将TFCC损伤分为创伤性损伤（I型）和退行性损伤（II型）两大类。
2.1外伤性损伤（I类）分为以下四种类型：
A.TFCC中央部撕裂或穿孔。B.TFCC从尺骨茎突的止点上撕裂，可伴或不伴尺骨茎突骨折。C.远端撕脱，伴尺月韧带损伤和/或尺三角韧带损伤。D.TFCC从桡骨附着缘上撕脱，可伴或不伴桡骨乙状切迹骨折。
2.2退变性损伤（II类）分为以下五种类型：
A.TFCC水平部在近侧面或远侧面磨损，但未发生穿孔。B.除水平部磨损外，还有月骨的尺侧面或尺骨头桡侧面软骨破坏。C.TFCC的水平部发生穿孔。D.退变进展期，月骨和尺骨头的关节面出现退行性变化，TFCC水平部穿孔，月三角骨间韧带断裂。E.尺腕撞击综合征的终末期，发生创伤性关节炎，TFCC水平部通常完全消失，月三角骨间韧带完全断裂。
腕关节镜检查具有诊断和治疗TFCC损伤的优势，被认为是诊断TFCC损伤的金标准[8]，可在直视下观察TFCC穿孔的大小、形态位置和韧带的断裂情况，并可观察腕骨和尺骨头是否存在软骨软化及观察腕骨间动态下的相互变化，得出明确诊断。行腕关节镜检查的适应证较为广泛，若出现腕关节经久不愈的疼痛，或依靠影像学检查无法确诊的腕部疾病，均可考虑在关节镜下进行确诊并治疗。一般对怀疑有TFCC损伤的患者首先保守治疗，大多数症状可缓解或消除，若保守3个月以上症状无缓解或加重，可予以腕关节镜检查。冯贵游和雷绍高[9]认为当检查发现腕尺侧有痛性卡塔声且症状持续3个月以上者，考虑三角纤维软骨复合体损伤，需行腕关节镜检查。
2.3.0TMRI运用于临床的前景和局限性
MRI是一种非创伤性的诊断方法，对软组织分辨率好，且具有随意取横断面、冠状面或矢状面断层图像等独特优势，对TFCC损伤能做出正确的评价。利用3.0TMRI多序列、多参数成像的特点，对TFCC损伤进行诊断，能及早发现轻微TFCC损伤，可以避免手术的痛苦。刘志强等[10]认为在TFCC损伤急性期使用高分辨率MRI能清晰地显示损伤部位及腕部细小结构的形态。朱庆生[11]也认为MRI不但能直接显示TFCC撕裂的部位，而且可显示与其相关的骨与软组织的异常改变，有助于TFCC损伤的诊断与鉴别诊断。而MRI关节造影与MRI相比，能更好的描述和定位TFCC及其周围韧带的损伤，具有更高的灵敏性和特异性[12，13]。
随着高场强MRI越来越多的运用于临床，磁共振对评价TFCC及其周围韧带的损伤具有很大的优势，但对MRI机器的场强、线圈、序列、扫描参数的选择及参数间的优化具有很高的要求。3.0T磁共振能敏感的评价TFCC及其周围韧带的损伤，由于微穿孔的存在，也可能导致假阳性[14]。磁共振不能代替腕关节镜检查，特殊的线圈和磁共振关节造影可以显著提高特异性和灵敏度[15]。由于腕关节体积小，结构复杂，诊断TFCC损伤具有很高的挑战性，高空间分辨率，高信噪比和高对比度分辨率的三个重要成像因素必须取得平衡，才能优化TFCC和手腕成像[16]。在场强的选择上，3.0T磁共振对诊断TFCC损伤的精度、敏感性和特异性均高于1.5T磁共振[17，18]。而7.0T磁共振和3.0T磁共振相比，又具有更高的空间分辨率和更多的新序列，能够更好的显示尺腕复杂结构[19]。在线圈的选择上，为了更好的观察TFCC及其腕骨间韧带的结构，3.0T磁共振的表面线圈要优于体积线圈，表面线圈能提供更优越的定性和定量结果[20]。
扫描序列的选择：1、脂肪抑制序列：脂肪抑制（STIR）技术可精确显示软骨缺损，采集时间短，化学位移伪影小。2、自旋回波（SE）和快速自旋回波（FSE）序列：二维SE或FSET1WI、T2WI和PDWI加用脂肪抑制技术是显示关节软骨最常用的MRI检查方法，T1WI可显示关节软骨的解剖细节，但不能分辨关节积液和软骨缺损，T2WI能清晰分辨关节软骨缺损和积液，但不能清晰显示软骨内异常信号，PDWI可清晰显示关节软骨缺损和软骨内成分异常，中等加权序列兼有PDWI和T2WI的优势，可更好的区分软骨下结构和软骨成分，魔角效应也比T2WI轻微。三维FSE技术是等体积成像，空间分辨率高，可增加显示关节软骨的准确性，对关节下骨结构显示欠佳。3、扰相梯度回波技术（SPGR），即在梯度回波之后，在选层梯度方向上再加一扰相梯度，消除残留的横向磁化矢量，图像显示为T1加权性质。在扰相梯度回波技术上用三维（three-dimensional3D）采集，即为3DSPGR序列成像，目前被认为是关节软骨形态学的标准序列，其敏感性高于2D技术。显示关节软骨为高信号，关节液和脂肪组织呈中等信号，两者之间形成对比，当再结合脂肪抑制（fat-suppressed，FS）时，关节软骨为唯一的高信号，关节液和骨髓均为低信号。其结合了三维成像分辨率高和压脂成像可增加动态图像的优点，且无层间干扰和信息丢失，使得软骨和邻近组织的信号对比大大提高。
3.0T磁共振对诊断TFCC及其周围韧带的损伤虽有优势，但也有局限性。表现为①3.0T磁共振机器成本贵、检查费用高，贫穷地区及经济条件差的患者不能接受。②梯度回波序列扫描时间长，年纪大的患者（如帕金森）或外伤疼痛难忍的患者不能耐受。③对于外伤病人或慢性腕关节疼痛病人，不能采取标准扫描，影像图像质量。④对于有MRI禁忌症的患者，不能接受检查。
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合成纤维篇5
关键词：乳腺纤维腺瘤；乳晕切口；乳腺腺体瓣成形术
手术切除是治疗乳腺纤维腺瘤的主要方法[1]。但是传统的放射状切口术后瘢痕明显，对患者美观影响较大，不适应现代审美观[2]。近年来，我院对乳腺纤维腺瘤患者行经乳晕切口联合乳腺腺体瓣成形术治疗，取得了较好效果。现将有关结果报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料选择2012年8月～2014年6月我院收治的乳腺纤维腺瘤患者共82例为对象。纳入标准：经病理诊断证实为乳腺纤维腺瘤；均在确诊后15d内行手术治疗；肿块直径5cm；有胸部手术史者；不能完成6个月随访者。在告知患者两种手术方法优劣后，由患者自行选择手术方法。根据采用的手术方法，分为观察组51例和对照组31例。所有患者均为女性。其中：观察组年龄18～37岁，平均（27.4±6.5）岁；肿块直径0.9～4.7cm，平均（2.9±0.8）cm。对照组年龄18～38岁，平均（27.2±6.8）岁；肿块直径1.0～4.8cm，平均（3.0±0.9）cm。两组在年龄、肿块直径等基础资料无统计学差异（P>0.05），研究具有可比性。
1.2方法两组均在术前行超声常规检查，定位乳腺肿块。术前30min予头孢唑林钠2.0g预防感染。观察组手术方法：仰卧位，局麻，沿乳晕边缘做弧形切口，分离乳腺腺体和表面后，用血管钳分离瘤体和周围组织，并行切除术。彻底止血后，周围腺体组织纵形放射状切开两个切口，然后游离大小腺体瓣，腺体瓣与术后残腔部位对应好后缝合。皮下组织间断缝合，皮肤采用皮内连续缝合。最后加压包扎。对照组手术方法：仰卧位，局麻后，根据肿瘤位置做放射状切口。其他操作与观察组同。术后沙袋压迫6h止血，并常规护理。所有患者均随访6个月，了解患者伤口愈合情况和并发症发生情况。
1.3观察指标记录两组手术时间、术中出血量、术后早期血肿发生情况。在术后6个月进行伤口愈合情况评价，并行美容满意度问卷。评价分为优、可、差。其中：愈合良好，患者无不良反应，为优；愈合欠佳，有明显瘢痕，但切口未化脓，为可；愈合欠佳，切口化脓，需切开引流，为差。美容满意度问卷采用我院自制的问卷量表，分为很满意、满意和差。很满意和满意例数与总例数的百分比为满意率。
1.4统计学处理所有数据均使用SPSS19.0进行统计学处理。计量资料使用（x±s）表示，t检验法检验。计数资料使用例（%）表示，χ2检验。P
2结果
2.1两组手术时间、出血量和早期血肿比较观察组手术时间为（44.2±5.4）min，术中出血量（28.7±6.5）ml，均显著高于对照组（t分别为9.472、9.538，P0.05）。见表1。
2.2两组伤口愈合和复况比较观察组伤口愈合优、可、差例数分别为47例（92.16%）、3例（5.88%）、1例（1.96%），与对照组有统计学差异（χ2=13.882，P
2.3两组美容满意度比较观察组对美容效果很满意、满意、不满意例数分别为44例（86.27%）、5例（5.80%）、2例（3.93%），美容满意率为96.07%，显著高于对照组（χ2=17.638，P
3讨论
内分泌激素失调是导致乳腺纤维腺瘤的主要原因[3]。手术切除是乳腺纤维腺瘤治疗的首选方法[4]。但是传统的放射状切口容易在术后形成明显瘢痕，不符合现代女性的审美观[5]。因此，探索既能达到有效治疗又能保证美观的手术方式在临床中具有重要价值。经乳晕切口利用了乳晕丰富的血液循环、皮肤薄、弹性好和乳晕部位隐蔽等特点，可以尽量完整的切除肿瘤，保持美观。但是由于部位隐蔽、血液循环丰富，经乳晕切口联合乳腺腺体瓣成形术手术时间较长、术中出血量较多[6]。从本研究结果来看，观察组手术时间较对照组延长了约10min，术中出血量则较对照组多了约9ml。术后早期血肿是经乳晕切口联合乳腺腺体瓣成形术常见并发症。本研究中观察组有2例发生早期血肿，但是早期血肿发生率与对照组无明显差异（P>0.05）。经分析原因，这可能与我院在术后护理干预中，重视早期血肿的预防和护理有关。这揭示了通过有效的护理可以降低早期血肿的发生。
本研究对所有患者均随访了6个月，了解患者伤口愈合、复况，并进行问卷调查掌握患者对手术的满意度。从结果来看，观察组伤口愈合情况显著好于对照组，观察组愈合优良率为92.16%，高出对照组约18个百分点。观察组1例复发，复发率显著低于对照组（P
综合本研究结果来看，虽然乳晕切口联合乳腺腺体瓣成形术切除乳腺纤维腺瘤手术时间较长，术中出血量较多，但是术后伤口愈合效果更好，患者对手术的满意度更高，对患者的破坏更小，值得临床运用。
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合成纤维篇6
ThehyaluronicsynthasemRNAexpressionsandhyaluronicacideffectsofastraglusonfibroblastsindiabeticfootulcer
【Abstract】ObjectiveTostudythehyaluronicsynthasemRNAexpressionsandhyaluronicacideffectsofastraglusonfibroblastsindiabeticfootulcer.MethodsThechangeofthehyaluronicsynthasemRNAexpressionsweremeasuredbysemi-quantitativeRT-PCR.thehyaluronicacidcontentwasusedtodetectbyradioimmunity.ResultsItshowedthatthehyaluronicacidsynthasemRNAexpressionsandhyaluronicacidcontentweresignificantlyhighercomparedwiththoseculturedwithoutastraglus（P<0.05）.ConclusionTheseresultssuggestastraglushasacertaineffecttoup-regulatedhyaluronicsynthasemRNAexpressionsandenhancehyaluronicsynthesizedonfibroblastsindiabeticfootulcer.
【Keywords】astraglus;diabeticfoot;fibroblast;hyaluronicsynthase;hyaluronicacid
正常伤口的修复包括炎症、增生和修复三个阶段，在伤口愈合过程中，稳定细胞和不稳定细胞都具有完全的再生能力，但能否重新构建为正常结构尚依赖细胞外基质，透明质酸作为细胞外基质的主要成分，主要由成纤维细胞分泌［1］；本实验体外用黄芪作用糖尿病足溃疡处成纤维细胞，通过检测成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸的分泌量，旨在探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的影响。
1材料与方法
1.1材料与主要试剂黄芪注射液（成都地奥公司），TRizolReagentTotalRNAIsolationReagent（GiBco公司），cDNA第一链合成Kit（上海生物工程公司）、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物合成（上海生物工程公司），DEPC、DNAmarker（华美生物公司），胎牛血清（四季清公司），异丙醇等常用化学试剂（Sigma公司或国产分析纯）；透明质酸放射免疫检测试剂盒（上海海研所）。透明质酸合酶引物正/负链序列：5′AAACCGCTGGAACAAGTC3和5′AACCCTGAGCCAATCAAA3′，GAPDH引物正/负链序列：5′TGCTTTCCGTCGTATCCA3′和5′CACCGTCAGTAGCCCAGT3′，扩增片段大小分别为175和221bp。
1.2方法
1.2.1成纤维细胞培养取溃疡创面组织，经0.01mg/L新洁尔灭浸泡10min后生理盐水漂洗，剪成1?3大小，贴壁2h后将组织块培养于含100ml/L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，体积分数为5%CO2，细胞生长至对数生长期后，将细胞悬液调整至1×107/L，移入24孔板中培养，待细胞贴壁后用含/未含20g/L黄芪的培养液进行培养，待瓶底长满细胞后，以2.5mg/L胰酶消化传代，培养6天后，收集细胞作相应检测。
1.2.2半定量RT-PCR检测透明质酸合酶mRNA表达细胞RNA的提取按TRizolReagent试剂盒说明书进行；用cDNA第一链合成Kit将RNA逆转录为cDNA按试剂盒说明书进行；半定量PCR反应扩增透明质酸合酶mRNA：PCR反应体系（50μl）：10×PCRBuffer（5.0μl），25mMMgCl2（3.0μl），4×dNTP（3.0μl），透明质酸合酶20uM引物正链（1.5μl），20uM引物负链（1.5μl），GAPDH20uM引物正链（0.75μl），20uM引物负链（0.75μl），cDNA（2.0μl），5U/μlTag(0.8μl)，H2O（33.2μl）。半定量RT-PCR反应（同一管内进行）；PCR反应条件：透明质酸合酶mRNA扩增：先加透明质酸合酶引物（1.5μl+1.5μl），95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；GAPDH加入：取上述产品加GAPDH引物（0.75μl+0.75μl），94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；PCR产物各取10μl用1.5g/L琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色观察。一次性成像系统照相，各条带的光密度值用彩色图像摄录输入仪(型号：JVCky?F30B3-CCD)输入，德国KONTRONIBAS2.0全自动图像分析系统进行分析，分析结果用透明质酸合酶/GAPDH计算得到透明质酸合酶mRNA表达的半定量结果。
1.2.3体外合成透明质酸含量的测定留取用含/未含20g/L黄芪的培养液进行细胞培养后每次换液的上清液，用全自动γ计数仪检测透明质酸含量，操作按试剂盒说明书进行。
1.3统计学方法计量资料用x±s表示，差异比较采用配对t检验。
2结果
2.1含/未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达RT-PCR结果分析将用含/未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞mRNA与内参照GAPDH于同一条件下同时扩增，其扩增产物强度经电泳后图像分析，结果表明，用含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达均明显高于未含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞的表达，结果经t检验比较，差异有显著性（P<0.05），具体结果见表1、图1。
2.2含/未含黄芪的培养液细胞培养后的上清液中透明质酸含量比较含黄芪的培养液细胞培养后的上清液中透明质酸含量明显高于未含黄芪的培养液细胞培养后的上清液，结果经t检验比较，差异有显著性（P<0.05），具体结果见表2。表1含/未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达比较（略）表2含/未含黄芪的培养液细胞培养后的上清液中透明质酸含量比较（略）
3讨论
糖尿病溃疡久治不愈，机理十分复杂，至今尚不完全清楚，成纤维细胞功能低下是其中的原因之一［2］，临床观察发现用黄芪治疗糖尿病足溃疡，能加速溃疡的愈合［3］。同时对黄芪促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用进行了研究，从细胞学、蛋白及分子水平观察细胞形态、增殖特性、细胞周期，免疫组织化学方法检测PCNA蛋白表达，半定量RT-PCR检测P21WAF1mRNA的表达。黄芪作用后成纤维细胞形态趋于正常，细胞倍增时间缩短，G1期阻滞率降低，PCNA蛋白表达增高，P21WAF1mRNA的表达上调将近4倍，证实黄芪可促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞形态修复及细胞增殖［4］。
在损伤修复的肉芽组织形成过程中，肉芽组织中的基质主要为透明质酸和硫酸软骨素，主要是由成纤维细胞合成［5］；透明质酸作为细胞外基质的主要成分之一，它通过与细胞膜受体相结合而影响细胞的生物学活性，并与细胞的有丝分裂密切相关，溃疡愈合的速度及程度与成纤维细胞分泌透明质酸的量有直接的关系，透明质酸的增高可以促进伤口愈合，当透明质酸增高到一定限度时，愈合过程就表现为瘢痕的异常增生而成增生性瘢痕［6］；成纤维细胞功能低下而使透明质酸分泌量减少可能是糖尿病溃疡难愈合的原因之一，Bertheim等对正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞分泌的透明质酸进行比较，发现后者的透明质酸的含量显著高于前者，用免疫组织化学染色方法也支持这一结果，增生性瘢痕中的透明质酸明显高于正常皮肤［7］。本实验用含/未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞，结果用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸高于未含黄芪的培养液培养的细胞，且差异有显著性（P<0.05），说明黄芪能通过上调成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达，而使透明质酸分泌量增高，有利于伤口肉芽组织的形成，加速伤口的愈合。从一侧面证实黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的恢复有一定的影响。
【参考文献】
1WayneKS，AlexanderGD，GordonRT，etal.Physiologyandhealingdynamicsofchroniccutaneouswound.AmJSurg，1998，179(1):26.
2MingardiR，PasqualettiP，StrazzaboscoM，etal.Riskfactorforulceration，amputationanddeath:longteamprospectivestudy.Abstractvolumeofthe36thannualmeetingofEASD:A2432000Jerusalem.
3肖正华，陈定宇，周倩，等.黄芪注射液加胰岛素混合液外敷治疗糖尿病足溃疡69例疗效观察.新中医，2005，37（6）:50-51.
4邓家德，李扬，肖正华，等.黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用的研究.江西医学检验，2005，23(5):389.
5李玉林.病理学.北京：人民卫生出版社，2004，16.