分子遗传学研究方法(6篇)
分子遗传学研究方法篇1
关键词：云南松种质资源；遗传多样性；种源选择
中图分类号：S791.257S718文献标识码：A文章编号：1671-3168（2011）03-0039-04
ResearchAdvancesofPinusyunnanensisGermplasmResourcesand
GeneticDiversity
YUMao-yuan
（YunnanInstituteofForestryInventoryandPlanning,Kunming650051,China）
Abstract:Pinusyunnanensisisanimportantforesttreespeciedistributedinsouth-westChina.Itaccountsfor70percentoftheforestareaandplaysaveryimportantroleintheecologicalandeconomicalconstructionofYunnanProvince.ItisacceptedthatunderstandingtheconservationandutilizationstatusofthePinusyunnanensisgermplasmtoascertainthegeneticvariationandgeneticdiversity,isanimportantbasisforresourceconservationandhighqualityforesttreebreeding.Inthispaper,recentstudiesonthegermplasmcollection,preservationaswellasgeneticdiversityofPinusyunnanensiswerereviewedandanalyzed.Theresultsshowedthatresearchonmorphology,physiology,ecology,geneticsandgermplasmpreservationofPinusyunnanensishasmademanynewachievements.ItrevealsawealthofgeneticresourcesanddiversegeographicalprovenanceofPinusyunnanensis.
Keywords:Pinuyunanensisgermplasmresourcegeneticdiversityprovenanceselection
收稿日期：2011-04-06.
作者简介：余茂源（1975-），男，广西融安人，助理工程师.从事森林资源调查规划工作.
云南松（PinusyunnanensisFranch）是松科常绿针叶乔木，广泛分布于北纬23°～29°，东经98°～106°的东南部、四川西南部、贵州西部、广西西部及云南的大部分地区【sup】［1］【/sup】.云南松以云南高原为其起源和分布中心，在形态水平上分化强烈，生态地理变异突出，形成了生态小种地盘松（P.yunnanensisvar.pygmaea（Hsueh）Hsueh）和地理小种细叶云南松（P.yunnanensisvar.tenuifoliaChengetLaw）.云南松具有生长较快、材质较好、耐干旱瘠薄、天然更新能力强等优良品性，是西南地区荒山造林先锋树种和主要的用材树种【sup】［2-3］【/sup】.林木种质资源是生物多样性和生态系统多样性的基础，是林木育种中必不可少的繁殖材料，是林木遗传多样性的载体，是林木良种选育的物质基础.林木种质资源的保存与评价是林业可持续发展的基础，对区域性林业经济的发展与生态环境改善具有积极意义.近年来，我国在云南松林木种质资源保存、评价及利用现状方面进行了大量的工作，笔者在此旨在通过对云南松种质资源的收集保存及遗传多样性研究进展进行综合分析，为进一步开展云南松的保护与利用提供参考.1种质资源保存与评价
林木种质资源的保存是生态环境与林业经济发展的重要内容，是实现生物多样性的重要举措，也是林木良种繁育充分必要的物质基础【sup】［4］【/sup】.如何长期保护和不断完善林木树种资源，以保护其遗传多样性并对其遗传资源进行有效地保护和利用，是林木种质资源保存与利用中迫切需要解决的问题.云南松的遗传育种研究始于20世纪80年代，主要开展了遗传基础及遗传变异、种源、遗传增益与良种选择、良种繁育技术等方面的研究工作.
在云南松地理种源选择和种源区划方面，舒筱武等率先在国内进行了研究.在云南松自然分布区内收集各地理生态区域的代表种源41个，在云南省5个生态区进行田间试验，发现种源间的生长差异显著，并为各试区筛选出2～3个较佳种源，单位面积蓄积量比对照提高47.9%～76.7%.根据研究结果把云南松自然分布区划分为4个种源区，并提出云南松种子调拨意见【sup】［5-6］【/sup】.刘世俊等对四川省12个县、云南省11个县的云南松天然优良林分的选择进行了研究，以树高年均生长量、径高比和木材纹理平均扭转度等指标作为林分选择主要性状，应用多元回归分析、径表型相关和通径分析，按照综合选择指数的大小评定林分优劣等级，将云南松天然林划分为4类，其中选择指数大于或等于平均综合选择指数加半个标准差的林分即为中选的优良林分，这为云南松母树林和采种林的选择提供了科学依据【sup】［7］【/sup】.
尹擎等【sup】［8］【/sup】通过对采自云南、贵州、四川、广西、等地64个不同经纬度、海拔的云南松代表性天然林分的种源进行栽培试验.6年的试验结果发现，云南松各种源间生长差异显著，优劣种源间高生长相差达1.98倍，优良种源高生长超过对照10.1%～34.6%.云南松高生长随种源地经度、海拔升高呈降低趋势；径生长随经度升高而增加，随纬度、海拔升高而减小.研究还筛选出腾冲托盘山、腾冲火山、腾冲古永、丽江石鼓、大理、寻甸功山、会泽拖茨、下察隅冷冷塘、昌宁岔河等9个地点种源为优良种源.
调查发现，云南松的天然林直干株率为81%～84.4%，直干、直纹率为38.7%～62.2%.而人工林直干株率为11.10%，直干、直纹株率仅为3.7%.对云南松木纹理进行后代遗传测定发现，天然林中直干直纹的云南松优树木纹理的遗传品质最高.因此，可以通过选择优良的直纹单株（优树）建立无性系种子园作为良种生产的基地.何富强【sup】［9］【/sup】等开展了优树选择、优树半同胞后代测定和早期预测、嫁接繁殖技术、无性系种子园营建技术和种子园植株的生长和结实规律的研究工作，并在一平浪林场、弥渡县建成54.9hm【sup】2【/sup】的云南松无性系种子园，所生产出的良种已应用于生产性造林，营造的云南松林不仅保存率高，直纹株率达83.3%，而且林木生长快、生长量大.
伍聚奎和周蛟【sup】［10］【/sup】利用林分中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级木的树高年平均生长量来评价林分的速生丰产，用木材纹理倾斜度来评价林分木材的经济价值，调查林分的环境因子.数量化以后，通过电子计算机来估算林分的树高年均生长量和木材纹理倾斜度的表型理论值，进而估算林分的遗传理论值，以此来建立标准地内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的树高年均生长量及木材纹理倾斜度的理论值的综合预报公式.伍聚奎和周蛟【sup】［10］【/sup】提出“滇中云南松天然林优良林分的选择标准和方法”，利用树高年均生长量和木材纹理倾斜度的综合选择指数的大小来评价林分的优劣.周蛟等【sup】［11］【/sup】通过在永仁县白马河林场子代林的试验，利用“滇中云南松天然林优良林分的选择标准和方法”选择出优良林分，其速生的树高生长量的遗传力为76%，丰产的蓄积生长力为47.48%，遗传增益为36.44%.通过这一方法及标准选择出来的云南松优良林分，用其母树林种子造林，不仅可改变云南松林中树干弯曲及木材纹理扭曲的不良特性，还可以提高云南松林分的木材产量.曾郁珉和谢红春【sup】［12］【/sup】对采自白马河林场、古永林场和保山林场的云南松母树林的62份种子及1份永仁县商品种子和1份云南省混合商品种子栽培7年后的树木进行研究，结果表明，母树子代林在树高、地径上都比一般林分好,其树高、地径、材积生长量与商品种子之间均存在显著差异.其材积遗传增益为5.63%，具有极显著的增产效果.研究表明，利用母树林种子进行造林可以提高云南松的木材质量和生长量，获得良好的经济效益.2遗传多样性研究
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生物种内基因的变化，包括同种显著不同的群体间或同一群体内的遗传变异.遗传多样性的表现是多层次的，可以表现在外部形态、生理代谢及染色体、DNA分子等水平上.植物种质资源内蕴含着极其丰富的遗传变异和各种性状的有利基因，它是育种改良作物的物质前提，也是人类用以选育新品种和发展生产的物质基础.
利用形态性状来研究遗传变异是简便易行且快速的手段【sup】［13］【/sup】.王昌命等【sup】［14-15］【/sup】对云南松针叶进行研究后指出，云南松种群的针叶形态特征和结构特征均表现出多态性，从滇东南―滇中―滇西北，针叶长度逐渐减少，3针1束的比例、短枝上的针叶数目、针叶断面积均表现出“小型化”趋势，叶鞘的长度随海拔的升高有增加的趋势，针叶的伸长生长通常表现出“优势针束优势生长”的原则，针叶内部的基本结构特征较为稳定，但其组成分子的数量特征值变化较大.云南松花粉粒形态、大小、气囊数目及其大小的变异极其复杂多样，在松属植物中少见.云南松居群具有2个气囊的正常花粉粒，其形态变异有20.2%源于居群间，有79.8%源于居群内个体间和个体（家系）内，其中个体（家系）内花粉粒形态变异方差分量占88.3%，个体（家系）内花粉粒形态的变异较大，环境饰变作用明显【sup】［16］【/sup】.虞泓【sup】［17］【/sup】通过对云南松不同种群的树皮、韧皮部、针叶、球果、种子及种翅、小孢子叶球及花粉进行系统地研究后发现，云南松种群具有较高的遗传多样性，同时各种群间在形态变异上也表现出明显的多样性，针叶、球果、种子、种翅和花粉等性状的变异分化系数为21.3%～49.8%，平均形态分化系数约36.4%.云南松种群间形态变异明显，是松属中分化较为突出的种类.同时，通过对各形态性状的巢式等级方差分析结果表明，随着种群间分布距离缩小，种群间基因交流频率变大，种群间形态性状相似性越高；种群间生态环境差异越大，趋异适应性越明显.
虞泓和黄瑞复【sup】［18］【/sup】通过研究6个云南松居群间、个体间和细胞间的核型变异式样及其分化发现，云南松居群核型变异不显著，与整个松属植物的核型变异趋势相同.所研究云南松各居群核型公式均为2n24m（6-10SAT），核型类型均为1A.各居群仅在相对长度系数、臂比和次缢痕数目等方面有小的变化.巢式方差等级分析表明，云南松染色体结构变异有10%左右来源于居群间，有90%左右来源居群内个体间或细胞间.其分化系数略低于基因位点的分化系数（G【sub】ST【/sub】11%），但大大低于形态分化系数（V【sub】ST【/sub】36%）.
云南高原生态地理环境的错综复杂和生境中生态因子组合的多样性与复杂性，大大增加了云南松种群变异的多样性和复杂性.虞泓通过对云南松15个居群33个等位酶位点进行的遗传多样性研究发现，云南松15个居群的遗传多样性指标较高，其多态位点变异百分率为57.6%～78.8%，每个位点等位基因平均数为1.8～2.3个，观察杂和度H【sub】o【/sub】为0.109～0.177.通过与近缘的高山松及思茅松比较发现：云南松居群间遗传分化系数最大（G【sub】ST【/sub】0.134），约86.6%的遗传变异分配在居群内，13.4%的遗传变异存在于居群间；高山松大约有11.2%的遗传变异存在于居群间（G【sub】ST【/sub】0.112）；思茅松大约有9.3%的遗传变异存在于居群间（G【sub】ST【/sub】0.093）.云南松种群间遗传分化程度在世界松属植物中居中等水平，但在中国松属植物中居较高水平【sup】［17］【/sup】.云南松以云南高原为分布中心，东延伸到云南与贵州和广西交界的南盘江和红水河流域，北至四川的西南部，西北分布到的东南部.云南松分布区范围大，生态环境复杂是其居群间遗传分化系数较大的重要原因【sup】［19］【/sup】.通过对云南省境内不同地理范围云南松比较发现，云南松种群遗传多样性呈现中部低而南北端高的变异式样.
云南松是西南地区主要用材树种之一，也是其分布区内贫瘠地荒山造林的先锋树种.近年来的大量调查研究表明，在云南高原不同生态地理背景中云南松居群其形态特征表现出明显不同的变异式样【sup】［3,19］【/sup】.但迄今对这些变异的遗传基础仍研究不足，一些研究结果也因采样策略及实验方法的不同，所反映的结果也出现不一样的趋势.刘占林和杨雪【sup】［20］【/sup】利用cpSSR和AFLP标记比较了巴山松、黄山松、油松、马尾松以及云南松的遗传多样性与遗传分化结果.发现5种松树都表现出较高水平的遗传多样性与种间分化，而云南松的遗传多样性水平在几种研究松属植物中最低，不同于以前的一些研究结果.
另外，松属植物基因组含量大、构成复杂，松树间广泛的杂交与基因渗透更导致物种基因组的混淆，因此许多松树近缘种间关系模糊不清.在一些松属植物分布的接壤地带及2个种的居群分布交错地带经常形成自然的杂交种群并伴随着基因渗入【sup】［17］【/sup】.云南松种群在其分布区的北部和南部分别与高山松、思茅松种群形成分布交错地带，由于种群间的基因渗入，杂交种群的多态百分率和杂合度明显高于非杂交种群，这也是云南松种群遗传多样性呈现中部低而南北端高的变异式样的一个重要原因.3结语
近年来，对云南松的形态、生理、生态、遗传与种质资源保存等方面的研究已取得许多新的成果，并揭示了云南松丰富的遗传资源及多样的地理种源.云南松在我国西南地区被广泛用于人工造林，是云南省重要的经济及用材树种，约占云南省森林面积的70%.随着国家天然林保护与退耕还林工程的实施，云南松林的分布面积将更加扩大，云南松林保护与培育研究已经成为云贵高原森林资源经营管理及其可持续发展的重要任务之一【sup】［21］【/sup】.随着云南松木材与非木材资源的开发利用，其资源与经济价值将更加显现，也必将在国民经济建设和生态建设中发挥更加重要作用.鉴于云南松在林业生产上的重要性，摸清其种源间变异规律，合理有效地对其进行保存，是更好地利用的重要前提.同时，由于云南松分布地域广、范围大、生境条件复杂，要合理有效地保存其种质资源存在一定的难度.因此，在现有研究基础上，对其种质资源全面保存和遗传多样性进行深入研究将有助于更好地进行可持续的开发与利用.
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分子遗传学研究方法篇2
【关键词】非物质文化遗产；城市软实力；文化
十以来，山东省委、省政府着眼山东发展大局作出了加快济莱协作区建设的重要战略部署，莱芜科学发展面临难得的机遇。如何加大莱芜传统文化对外宣传力度，提高莱芜的知名度和影响力成为一个急切的研究课题。通过对莱芜传统非物质文化的挖掘，不仅能够宣传莱芜悠久的历史文化，而且能够树立一批响亮的带有莱芜特色的文化符号，通过这些软实力，使之成为莱芜形象的代言和文化发展的引擎。
“传承非物质文化遗产提升莱芜文化软实力”，需要对整个莱芜非物质文化遗产进行拉网式调研，弄清楚莱芜非物质文化遗产的分布和现状，对于有文化转换产品和旅游开发价值的非物质文化遗产进行开发利用论证，以便充分发挥其文化与经济价值，为莱芜经济社会发展服务。着眼于莱芜本土非物质文化遗产的来龙去脉和历史传承，本着“保护为主、抢救第一，合理利用、传承发展”的宗旨，以挖掘历史、传承文明为中心，紧密联系莱芜本土非物质文化遗产的细节和特点，力求图文并茂的解读非物质文化遗产背后的历史和文化，引导莱芜精神文明建设和增强莱芜人民的归属感和自豪感
1莱芜非物质文化遗产的现状
莱芜是嬴、牟故地，具有悠久的历史和独特的文化遗存，在民俗文化、民间技艺、民间传说等领域存在着多样的非物质文化遗产，自2004年中国民族民间文化保护工程启动以来，依据莱芜实际情况，莱芜已圆满完成了非物质文化遗产普查任务。
列入非物质文化遗产部级名录的有莱芜梆子、莱芜锡雕，莱芜梆子作为山东地区具有典型代表的非物质文化遗产，已经创作出了《儿行千里》、《长勺之战》、《种子》等一大批艺术精品。极大地提升了莱芜的知名度和城市文化软实力。花鼓锣子、蹉地舞、长勺之战的传说、吕家泥塑、莱芜张氏吹打乐、孟姜女的传说等10项列入了省级名录。并且又涌现出了一大批省级非物质文化遗产传承人，经省文化厅批准，设立了省级非物质文化遗产传习所：鲁王工坊锡雕艺术研究院，省级非物质文化遗产研究基地：莱芜梆子剧团。
2莱芜非物质文化遗产研究具体思路。
2.1非物质文化遗产剧（节）目演出等节会活动
充分利用文艺团体、电视媒介，大力开展国家、省非遗项目的宣传推介，完善文化产业链，为文化产品走向市场打下了坚实基础。2009年创作的现代戏《儿行千里》，已成为具有莱芜特色的艺术精品，曾在全省进行巡演，2012应邀在中央党校、国家行政学院巡演，后在国家评剧院参加了全国优秀剧目展演，受到了全省乃至全国人的欢迎。2014年又创作了现代戏《种子》，因此要借鉴莱芜梆子《儿行千里》、《长勺之战》、《种子》的成功经验，定期举办艺术节，积极推广莱芜文化，走出山东，在国家舞台上争创佳绩。
2.2非物质文化遗产成果的展示和衍生物质产品的推广
组织非遗项目进社区展示，并在非物质文化遗产展厅经常举办宣传展示活动，进一步普及非物质文化遗产保护知识，增强全社会保护意识，营造全民共同参与保护非物质文化遗产的良好氛围。
积极参加省市文化遗产申报和全国非物质文化遗产博览会等大型活动，通过深入推广莱芜锡雕、莱芜梆子、燕子石、等一系列非物质文化遗产项目，不仅很好地宣传了莱芜的地方特色文化，而且打造了莱芜浓厚的城市文明氛围，加强了精神文明建设，同时也优化了招商环境。
2.3挖掘非物质文化遗产背后的历史文化讯息
莱芜历史悠久，人文资源丰富，特别是被确定为“伯夷封地，嬴秦故里”，更增加了莱芜人的归属感和自豪感。为加大对外宣传力度，提高莱芜的知名度和影响力，编纂出版一批地方历史文化丛书，着重宣传嬴秦始源、一鼓作气等历史文化传承和近代大型莱芜战役纪念馆等都可以成为莱芜文化名片，增加城市文明水平和历史底蕴。
3非物质文化遗产的研究方法
3.1行动研究法是本课题研究的主要方法。
在挖掘莱芜非物质文化遗产过程中，边实践，边探索，把研究与实践紧密地结合起来，边归纳，边总结，最终形成科学的策略、经验、理论等成果，这是本课题研究的最重要方法。
3.2文献研究法
通过搜集、鉴别、整理文献，并积极搜集与本课题研究相关的信息，使课题实施建立在扎实的理论支撑基础上。嬴秦始源、一鼓作气等历史文化传承需要整理搜集历史文献，使课题研究建立在严谨的论述之上，增强其可信性和传承感。
3.3个案分析法
开展课题引路、研讨展示活动，收集典型个案，认真剖析、反思。通过莱芜锡雕、莱芜梆子、燕子石等一系列典型的非物质文化遗产案例，来引导莱芜精神文明建设和增强莱芜人民的归属感和自豪感。
4研究非物质文化遗产的理论创新程度和实际应用价值
4.1理论创新
关于莱芜非物质文化研究尽管已经有部分研究成果，但就我市情况看还没有开展过系统调查和开发论证的课题研究，尤其是在国家大力发展文化产业和《山东省文化产业发展专项规划（2007-2015）》实施后的新形势下，这个课题的研究有深入开展的必要性和迫切性。十以来，省委、省政府着眼山东发展大局作出了加快济莱协作区建设的重要战略部署，莱芜科学发展面临难得的机遇。如何加大莱芜传统文化对外宣传力度，提高莱芜的知名度和影响力成为一个急切的研究课题。
4.2应用价值
分子遗传学研究方法篇3
关键词：文化算法；遗传算法；粒子群算法；差分进化；免疫克隆选择算法
中图分类号：TP301.6文献标识码：A文章编号：1007-9599（2013）09-0000-02
1引言
Reynolds于1994年提出文化算法，该算法的双层进化机制为进化计算中的知识引导提供了通用框架，具有许多优良特性。文化算法不仅克服了其他进化算法的局限性，而且还克服了其他进化算法产生的退化现象，文化算法能根据具体情况设计种群空间、信仰空间、接受函数和影响函数，有很强的可扩充性，易于与其他方法结合，能够使其以一定的速度进化和适应环境，并互相弥补各传统算法的不足，提高算法的全局搜索能力、收敛速度、收敛性、计算精度等，适用范围广泛。
文化算法及其与传统智能算法相结合的研究刚刚兴起，本文在介绍文化算法基本原理的基础上，对国内近五年文化算法与遗传算法、粒子群算法、差分进化算法、免疫克隆选择算法等相结合的研究进行了综述，为进一步深入研究文化算法与其他智能算法相融合以及多个智能算法相结合的应用提供了借鉴和参考。
2文化算法基本原理
文化算法（CA）是由种群空间和信仰空间构成的双层进化机制，主要包括三部分：种群空间、信仰空间和通信协议。文化算法的基本框架如图：
种群空间是生物个体根据一定的行为准则进化而组成的。信仰空间是文化形成、存储、更新、传递的进化过程。两个相对独立的进化过程，但又由通信协议将二者联系在一起，相互影响和促进，通信协议主要包括接受函数和影响函数。
3文化-遗传算法
遗传算法（GA）是一种基于自然选择和基因遗传学原理的随机并行搜索算法。遗传算法随着算法的进行其种群多样性逐渐消失，很容易于陷入早熟收敛，引入随机种群可以改善种群的多样性问题，但是又影响到算法的效率。目前，一些学者通过文化算法和遗传算法结合，将遗传算法纳入文化算法的框架，形成基于遗传算法的主群体空间和信念空间两大空间，从收敛速度、收敛效率两方面来提高遗传算法的性能。文献[1]提出一种基于模式学习的文化遗传算法，该方法充分利用了优秀个体所包含的特征信息起引导作用，算例表明，文化-遗传算法可提高算法收敛速度。文献[2]为解决函数优化问题，针对遗传算法的不足之处，将文化-遗传算法用于函数优化，实验结果表明，新算法能够提高效率和精确度。文献[3，4]将遗传算法中交叉和变异算子嵌入文化算法的主群体空间进行传统的遗传算法操作，形成一种双层进化结构，该算法在计算效率和求解质量上均具有较好的效果。文献[5]和文献[6]分别针对DNA编码问题和装载机的连杆机构传动比问题，采用文化遗传算法克服了遗传算法进化效率不高的问题，从而提高计算速度。文献[7]提出了一种基于文化算法的双层机制结构的知识迁移多用户交互式遗传算法模型，该模型有效提高各用户的进化收敛速度，减轻用户疲劳。
4文化-粒子群算法
粒子群算法（PSO）是在研究鸟类的群体行为时提出来的一种群智能算法。该算法虽简单，计算速度快，但收敛性、均匀性和局部搜索能力差。为了解决上述问题，并提高粒子群优化算法的精度与计算的效率，运用文化算法的并行计算能力及PSO的优点，将文化算法和PSO结合形成一种新型的智能算法，该算法利用优秀个体所包含的信息提高算法的收敛性，同时在局部最优问题上有一定的优越性，而且避免了群体早熟的发生。文化-粒子群算法的融合主要是将粒子群算法纳入文化算法的框架。
文献[8]将文化粒子群算法用于求解置换流水车间调度问题中的最小化最大完成时间，通过不断与信念空间中的优秀个体交互，加快群体收敛速度，该算法具有较快的收敛速度。文献[9]基于粒子群算法的改进多目标文化算法用于求解多目标优化问题，测试结果表明，改进多目标文化算法能够在保持Pareto解集多样性的同时具有较好的均匀性和收敛性。文献[10]提出以随机粒子群作为信念空间，以粒子群作为种群空间的进化算法，集成了rPSO大范围、高效率搜索和PSO局部精细化搜索的优点，较好地克服了PSO易“早熟”和收敛速度缓慢等问题。[11]利用文化粒子群算法的优点，设计了一种可快速进行多维搜索求解所提的基于模式空间的测向算法。
5文化-差分进化算法
差分进化算法（DE）是一种采用实数矢量编码的并行搜索算法，其原理简单，受控参数少，易于编码与实现。但在收敛速度和搜索鲁棒性之间发生冲突，且后期收敛速度变慢，容易陷入局部最优。无法有效的求解工程中复杂的高维非线性优化问题等缺点。文化-差分进化算法有效解决复杂度问题、提高全局搜索能力和到达收敛速度快的效果。文化-差分进化算法的融合主要是将差分进化算法纳入文化算法的种群空间。文献[12]提出一种混沌差分文化算法，测试结果表明，该算法能有效的避免早熟收敛，搜索到全局最优解的能力得到显著提高。文献[13]提出的差分文化算法是一种求解实数优化问题的新算法，具有收敛速度快和优化效果好的显著特点，并把差分文化算法推广应用到其他高维参数优化问题。文献[14]将改进差分进化算法引入文化算法的种群空间，并应用于约束求解问题。通过对基准函数和丁烯烷化生产调度问题进行仿真，结果表明这一算法有比较好的全局搜索能力，加快了收敛速度，并降低了计算量。
6文化-免疫克隆算法
免疫克隆选择算法模拟生物学中的抗体克隆选择机理，通过克隆操作、免疫基因操作以及选择操作等新型算子，实现高效的搜索方法。免疫克隆选择算法有全局收敛能力差，选择机制又容易早熟收敛的缺点。文化-免疫克隆算法可兼顾全局探索和局部搜索能力，提高免疫克隆选择算法的收敛速度和进化性能，该算法主要将免疫克隆选择算法嵌入文化算法的种群空间，其应用前景广泛。文献[15]提出一种自适应免疫克隆选择文化算法，实验结果表明，该算法在整体上具有较好的全局寻优能力和解稳定性，且收敛速度较快。文献[16]提出了基于免疫文化算法的加热炉优化调度方法，通过利用免疫克隆的较强的搜索能力和文化算法信念知识的指导，使加热炉调度得到显著优化，不仅提高了轧制生产线的利用率，还缩短了加热炉的运行时间，减少了燃料消耗。文献[17]提出了一种基于免疫文化算法的封装式特征选择方法，实验表明该方法在降低数据维度和提高分类准确率上有着良好的效果。文献[18]采用文化算法的框架结构，将免疫克隆算法嵌入其中，利用免疫克隆算法的全局收敛性在数据库中迅速搜索关联规则，实验表明，该模型具有较快的收敛速度和所得关联规则的准确率较高。
7文化算法与其他智能算法结合
文化算法除了与遗传算法、粒子群算法、差分进化算法、免疫克隆选择算法融合外，还可以与其他智能算法相结合，如文化算法融合神经网络[19]，文化算法融合蚁群算法[20-21]。此外，文化与两种以上的智能算法融合研究也逐步兴起，但研究相对较少。
8结束语
文化算法是一种基于种群多进化过程的全局优化算法，通过文化算法与传统智能算法相结合可以提高算法的收敛速度、计算精度等，文化算法与传统智能算法的结合为解决复杂优化问题提供了新的途径，具有较好的应用前景。
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分子遗传学研究方法篇4
关键词：瓜类蔬菜；分子标记技术；辅助育种；研究进展
中图分类号：S642.036文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）04-0136-04
瓜类蔬菜在我国蔬菜生产中占有重要地位。分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映[1]。分子标记技术的出现，使植物育种的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育品种的有效性[2]。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子标记技术在蔬菜育种中的作用越来越受到重视[3]。本文综述了几种常见的分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的研究进展，以期为瓜类蔬菜高效分子育种体系的建立提供参考。
1分子标记技术种类
Bostein等（1980）最早利用限制性长度片段多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）作为遗传标记构建了遗传连锁图谱，开创了直接利用DNA多态性发展遗传标记的新阶段[4]。DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化[9]，与传统的遗传标记相比具有许多特殊优点，如不受环境、季节限制，不受个体发育阶段影响，不存在基因表达与否的问题等[5～8]。现已发展出十几种DNA标记技术，概括起来主要包括以下3种类型：
①基于杂交的分子标记技术，如RFLP。
②基于PCR扩增的分子标记技术，它又分为两类。一是仅基于PCR的扩增方法。它包括使用随机引物（Arbitraryprimer）进行扩增的随机扩增多态性DNA技术（RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD），和采用特定引物或引物对扩增的标记技术，主要有序列特异性扩增区（Sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR）、微卫星DNA（MicrosatelliteDNA），又称简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）和ISSR（Intersimplesequencerepeat）等。其中SCAR属于位点特异的PCR标记方法，其他则属于多位点标记方法，检测区域均与微卫星序列有关。二是PCR与酶切相结合的方法。主要指扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）和酶切扩增多态性序列（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence，CAPS）两类。其中AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增；而CAPS是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切片段的长度多态性。
③基于DNA序列和芯片的分子标记技术，如单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）。
每种DNA分子标记技术都具有各自的优缺点和适用性，需要研究者结合实际加以选择。
2分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的应用
分子标记技术主要涉及分子遗传图谱的构建、遗传多样性研究、品种纯度鉴定、亲缘关系鉴定、重要基因的标记与定位、分子标记辅助选择、基因的图位克隆等许多领域，其在瓜类蔬菜育种中的应用，提高了瓜类蔬菜作物的育种效率[10]。
2.1种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究
随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，植物遗传多样性的检测水平获得了显著提高，从形态学、细胞学（染色体）、生理生化水平逐步发展到分子水平，为物种起源、品种分类的研究提供了理论依据。分子标记技术检测的是基因组水平上的差异，非常稳定，不受外界环境影响，并且通过对遗传图谱的分析，可以准确区分品种间的差异，为种质资源亲缘关系和遗传多样性的分析提供可靠、有效的工具[11～13]。
赵娜等[14]采用61对SSR特异引物对46份厚皮甜瓜进行UPGMA聚类分析，结果显示，供试材料的遗传相似系数达到了0.62，说明这46份厚皮甜瓜材料的亲缘关系非常近。盛云燕等[15]在甜瓜SSR标记遗传多样性研究中，采用50对SSR特异引物对46份甜瓜栽培品种（系）进行分析，有48对引物扩增出谱带，其中46对具有多样性，结果显示，运用分子标记技术可以提高甜瓜栽培品种多样性分析的准确性。尚建立等[16]以我国西瓜、甜瓜种质资源中期库内1200份西瓜种质为材料，对果实重量、果肉颜色、中心糖、种子千粒重等12项主要植物学性状进行遗传多样性和相关性分析。高山等[17]采用RAPD和ISSR分子标记技术对38份苦瓜种质进行遗传多样性分析，两种标记技术都能扩增出各自的多态性谱带，反应了苦瓜种质丰富的遗传多样性；其中RAPD标记将供试苦瓜种质划分为3个类群6组，与张长远等[18]对苦瓜亲缘关系的RAPD分析结论基本一致。杨衍等[19]对36份苦瓜种质资源利用AFLP技术进行遗传多样性和亲缘关系评价分析，将供试材料分为2个类群。Gaikwad等[20]也做过类似的相关研究。李晓慧等[21]利用SRAP分子标记对西瓜品种的多态性进行分析，探讨了西瓜的遗传多样性。段会军等[22]对50个西瓜枯萎病菌株的RAPD、ISSR和AFLP分子标记的研究揭示了西瓜枯萎病菌株分子水平上的遗传多样性，同时也说明了西瓜枯萎病遗传分化较大，存在着比较丰富的遗传变异，为西瓜抗病育种和西瓜枯萎病的综合防治提供理论依据。Paris等[23]利用AFLP、ISSR、SSR标记对45个南瓜品种进行研究，将其分为3个亚种。黄秀丽[24]利用种子蛋白质与几种同工酶电泳及RAPD标记对南瓜属4个栽培种间的亲缘关系进行探讨，结果表明中国南瓜与美洲南瓜亲缘关系最近，与印度南瓜关系较远。
2.2分子标记辅助选择
传统的育种主要依赖于植株的表现型进行选择，环境条件、基因间的互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表现型选择效率，一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。分子标记辅助选择育种可以对作物在早期进行快速、准确的选择，减少育种过程的盲目性和周期性，提高育种效率，加速育种进程[25，26]。
王怀松等[27]以抗病的7-2和感病的7-1、7-3杂交组合与分离群体为试材进行了甜瓜抗白粉病连锁分子标记研究，建立了甜瓜抗白粉病AFLP标记技术体系，找到了一个与甜瓜白粉病抗病基因紧密连锁的AFLP标记：M60/E25-520。马鸿艳[28]利用获得的2对SSR标记结合田间接种鉴定对101份甜瓜种质资源进行抗白粉病筛选，结果显示，引物SSR04816平均符合率为81.4%，引物SSR01498平均符合率为68.6%，引物SSR04816鉴定结果符合率大于80%，可用于分子标记辅助选择育种。张晓波等[29]对甜瓜雌雄异花同株和雄全同株材料间杂交后代及回交后代的花性型分离进行研究，在F2代中利用SSR技术对单性花基因进行了分子标记筛选并找到了与该基因连锁的标记，遗传距离分别为7.0cM和29.5cM。孙晓丹等[30]利用形态学观察、经典遗传性状分析、AFLP分子标记等技术在形态学和分子标记水平上研究了黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律，开发出实用有效的分子标记，提高了黄瓜育种工作效率。为了加速培育出人们青睐的优质黄皮西瓜，王日升等[31]以西瓜黑皮母本（H97）和黄皮父本（2605）构建的BC1分离群体为材料，利用RAPD技术筛选出一个与黄皮性状基因连锁的RAPD标记AI09-1500，重组率为17.2%。
2.3品种纯度鉴定
种子质量的高低影响农作物产量及品质，在种子质量检验的各个指标中，品种纯度检验尤为重要。传统的品种纯度鉴定费时费力且受环境、人为等多方面影响。分子标记技术以种子的DNA作为检测对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，且不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题[32]。
羊杏平等[33]利用RAPD和ISSR两种分子标记技术鉴定西瓜杂交种抗病苏蜜和苏蜜5号的遗传纯度，成功发现了能用于纯度检测的7个RAPD母本特异引物、4个RAPD父本特异引物、2个ISSR母本特异引物及2个RAPD父母本特异标记共显性引物，对于西瓜杂交种的遗传纯度检测具有重要意义。李菊芬等[34]应用RAPD、ISSR和SSR三种分子标记技术对西瓜杂交种“东方红1号”和“8424”纯度的快速鉴定进行了研究，在73对SSR引物中，各筛选到3对多态性引物能够用于杂交种纯度鉴定，且SSR鉴定结果与大田形态鉴定结果一致。李菊芬等[35]研究还显示，应用筛选出的SSR引物组合，能够有效地检测出混杂在杂交种中的母本自交系种子，也能检测出其它不明来源花粉所导致的生物性混杂，提高了甜瓜杂交种纯度检测结果的准确度。
2.4遗传图谱构建及基因定位
分子遗传图谱是指以遗传标记为基础的染色体或基因位点的相对位置的线性排列图[36]。遗传图谱的构建是瓜类蔬菜分子研究的重要内容之一，是基因定位与图位克隆及基因组结构与功能研究的基础，为分子标记辅助育种提供依据。
路绪强等[37]利用甜瓜全雌系W1998（无雄花）与雌雄异花同株品系3-2-2（有雄花）杂交，F1代全部为雌雄异花同株，以F2代为试材，采用SSR分子标记构建甜瓜遗传图谱，并定位了甜瓜控制雄花分化基因（An），进一步完善了甜瓜性别分化的表达机制。王军辉等[38]利用抗黄瓜花叶病毒（CMV）的黄瓜材料F-3和感CMV的黄瓜材料HZL04-1为亲本，构建了包含190个F2代的遗传作物群体，采用SSR、EST-SSR、SCAR三种分子标记技术进行遗传连锁分析，构建了黄瓜遗传连锁图谱，该图谱为黄瓜抗CMV的QTL定位奠定了基础。易克等[39]以野生西瓜种质PI296341为父本，普通西瓜97103为母本，获得F8的重组自交系群体，通过16个SSR引物和5个ISSR引物组成的48个标记构建了一个包括11个连锁群的分子图谱，总长度为558.1cM，平均图距为11.9cM。Yeboah等[40]利用SRAP和ISSR标记技术对黄瓜F2代群体进行标记分析，共获得109个多态性标记，构建了包含7个连锁群的连锁图谱，基因位点平均间距为16cM。尽管分子标记在瓜类作物的遗传图谱和基因定位方面取得了很大进展，但是饱和度高且能满足育种需求的遗传图谱尚未见报道。
3问题与展望
近几年来，分子标记技术不断发展、完善，但是利用分子标记大规模培育瓜类蔬菜作物优良品系或品种的愿望仍未实现。多数研究仍处在起步阶段，缺乏合理有效的试验依据；瓜类作物的遗传图谱饱和度较低，无法满足育种的需求[41]；与传统的形态鉴别方法相比，DNA分子标记技术所需仪器精密、药品昂贵、程序复杂，难以普及和应用[26]。因此，今后应充分利用不同分子标记技术加快遗传图谱的整合工作，提高其饱和度，完善高密度遗传标记连锁图谱的构建，同时开展新型分子标记的研究，寻求经济实用的新性状标记，并与常规育种有效结合起来，为瓜类蔬菜育种提供更好的服务。
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分子遗传学研究方法篇5
1理论分子群体遗传学的发.展简史
经典群体遗传学最早起源于英国数学家哈迪和德国医学家温伯格于1908年提出的遗传平衡定律。以后，英国数学家费希尔、遗传学家霍尔丹(HaldaneJBS)和美国遗传学家赖特(WrightS)等建立了群体遗传学的数学基础及相关计算方法，从而初步形成了群体遗传学理论体系，群体遗传学也逐步发展成为一门独立的学科。群体遗传学是研究生物群体的遗传结构和遗传结构变化规律的科学，它应用数学和统计学的原理和方法研究生物群体中基因频率和基因型频率的变化，以及影响这些变化的环境选择效应、遗传突变作用、迁移及遗传漂变等因素与遗传结构的关系，由此来探讨生物进化的机制并为育种工作提供理论基础。从某种意义上来说，生物进化就是群体遗传结构持续变化和演变的过程，因此群体遗传学理论在生物进化机制特别是种内进化机制的研究中有着重要作用[1]。
在20世纪60年代以前，群体遗传学主要还只涉及到群体遗传结构短期的变化，这是由于人们的寿命与进化时间相比极为短暂，以至于没有办法探测经过长期进化后群体遗传的遗传变化或者基因的进化变异，只好简单地用短期变化的延续来推测长期进化的过程。而利用大分子序列特别是DNA序列变异来进行群体遗传学研究后，人们可以从数量上精确地推知群体的进化演变，并可检验以往关于长期进化或遗传系统稳定性推论的可靠程度[1]。同时，对生物群体中同源大分子序列变异式样的研究也使人们开始重新审视达尔文的以“自然选择”为核心的生物进化学说。20世纪60年代末、70年代初，Kimura[2]、King和Jukes[3]相继提出了中性突变的随机漂变学说:认为多数大分子的进化变异是选择性中性突变随机固定的结果。此后，分子进化的中性学说得到进一步完善[4]，如Ohno[5]关于复制在进化中的作用假说:认为进化的发生主要是重复基因获得了新的功能，自然选择只不过是保持基因原有功能的机制;最近Britten[6]甚至推断几乎所有的人类基因都来自于古老的复制事件。尽管中性学说也存在理论和实验方法的缺陷，但是它为分子进化的非中性检测提供了必要的理论基础[7]。目前，“选择学说”和“中性进化学说”仍然是分子群体遗传学界讨论的焦点。
1971年，Kimura[8]最先明确地提出了分子群体遗传学这一新的学说。其后，Nei从理论上对分子群体遗传学进行了比较系统的阐述。1975年，Watterson[9]估算了基于替代模型下的DNA多态性的参数Theta(θ)值和期望方差。1982年，英国数学家Kingman[10，11]构建了“溯祖”原理的基本框架，从而使得以少量的样本来代表整个群体进行群体遗传结构的研究成为可能，并可以进一步推断影响遗传结构形成的各种演化因素。溯祖原理的“回溯”分析使得对群体进化历史的推测更加合理和可信。1983年，Tajima[12]推导了核甘酸多样度参数Pi(π)的数学期望值和方差值。此后，随着中性平衡的相关测验方法等的相继提出[13~15]，分子群体遗传学的理论及分析方法日趋完善[16]。
近20年来，在分子群体遗传学的基础上，又衍生出一些新兴学科分支，如分子系统地理学(molecularphylogeography)等。系统地理学的概念于1987年由Avise提出，其强调的是一个物种的基因系谱当前地理分布方式的历史成因[17]，同时对物种扩散、迁移等微进化历史等进行有效的推测[18]。
2实验植物分子群体遗传研究内容及进展
基于DNA序列变异检测手段的实验分子群体遗传学研究始于1983年，以Kreitman[19]发表的“黑腹果蝇的乙醇脱氢酶基因位点的核苷酸多态性”一文为标志。以植物为研究对象的实验分子群体遗传学论文最早发表于20世纪90年代初期[20，21]，但是由于当时DNA测序费用昂贵等原因，植物分子群体遗传学最初发展比较缓慢，随着DNA测序逐渐成为实验室常规的实验技术之一以及基于溯祖理论的各种计算机软件分析程序的开发和应用，实验分子群体遗传学近10年来得到了迅速的发展，相关研究论文逐年增多，研究的植物对象主要集中在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)及重要的农作物如玉米(ZeamaysL.)、大麦(HordeumvulgareL.)，水稻(OrazysativaL.)、高粱(SorghumbicolorL.)、向日葵(HelianthusannuusL.)等上[16]。其研究内容涵盖了群体遗传结构(同源DNA分化式样)、各种进化力量如突变，重组，连锁不平衡、选择等对遗传结构的影响、群体内基因进化方式(中性或者适应性进化)、群体间的遗传分化及基因流等。同时，通过对栽培物种与野生祖先种或野生近缘种的DNA多态性比较研究，分子群体遗传学在研究作物驯化的遗传学原因及结果等也取得了重要的进展，如作物驯化的遗传瓶颈，人工选择对“驯化基因”核苷酸多态性的选择性清除(selectivesweep)作用等等。
2.1植物基因或基因组DNA多态性
分子群体遗传学的研究基础是DNA序列变异。同源DNA序列的遗传分化程度是衡量群体遗传结构的主要指标，其分化式样则是理解群体遗传结构产生和维持的进化内在驱动力诸如遗传突变、重组、基因转换的前提。随着DNA测序越来越快捷便利及分子生物学技术的飞速发展，越来越多的全基因组序列或者基因序列的测序结果被发表，基因在物种或群体中的DNA多态性式样也越来越多地被阐明。
植物中，对拟南芥和玉米基因组的DNA多态性的调查最为系统，研究报道也较多。例如，Nordborg等[22]对96个样本组成的拟南芥群体中的876个同源基因片段(0.48Mbp)的序列单核苷酸多态性进行了调查，共检测到17000多个SNP，大约平均每30bp就存在1个SNP位点。而Schmid等[23]的研究结果显示:拟南芥基因组核甘酸多态性平均为0.007(W)。Tenaillon等[24]对22个玉米植株的1号染色体上21个基因共14420bp序列的分析结果显示玉米具有较高的DNA多态性(1SNP/27.6bp、=0.0096)。Ching等[25]研究显示:36份玉米优系的18个基因位点的非编码区平均核苷酸多态性为1SNP/31bp，编码区平均为1SNP/124bp，位点缺矢和插入则主要出现在非编码区。此外，其他物种如向日葵、马铃薯(Solanumtuberosum)、高粱、火矩松(PinustaedaL.)、花旗松(Douglasfir)等[26～30]中部分基因位点的DNA多态性也得到调查，结果表明不同的物种的DNA多态性存在较大的差异。
繁育方式是显著影响植物基因组的DNA多态性重要因素之一。通常来说，自交物种往往比异交物种的遗传多态性低，这已经被一些亲缘关系相近但繁育方式不同的物种如Lycopersicon属植物和Leavenworthia属植物的种间比较研究所证实[31，32]。但是在拟南芥属中则不然，Savolainen等[33]比较了不同繁育方式的两个近缘种Arabidopsisthaliana(自交种)和Arabidopsislyrata(异交种)的乙醇脱氢酶基因(AlcoholDehydrogenase)的核苷酸多态性，结果发现A.thaliana的核苷酸多态性参数Pi值为0.0069，远高于A.lyrata的核苷酸多态性(Pi=0.0038)。
2.2连锁不平衡
不同位点的等位基因在遗传上不总是独立的，其连锁不平衡程度在构建遗传图谱进行分子育种及图位克隆等方面具有重要的参考价值。Rafalski和Morgante等[34]在比较玉米和人类群体的连锁不平衡和重组的异同时对连锁不平衡的影响因素做了全面的阐述，这些因素包括繁育系统、重组率、群体遗传隔离、居群亚结构、选择作用、群体大小、遗传突变率、基因组重排以及其他随机因素等。物种的繁育系统对连锁不平衡程度具有决定性的影响，通常来说，自交物种的连锁不平衡水平较高，而异交物种的连锁不平衡水平相对较低。但是也有例外，如野生大麦属于自交物种，然而它的连锁不平衡水平极低[35~37]。
拟南芥是典型的自交植物，研究表明:拟南芥组基因大多数位点的连锁不平衡存在于15～25kb左右的基因组距离内[22]，但是在特定位点如控制开花时间的基因及邻接区域，连锁不平衡达到250kb的距离[38]。拟南芥基因组高度变异区段同样具有较强的连锁不平衡[39]。这些研究结果说明拟南芥非常适合构建连锁图谱，因为用少量的样本就可以组成一个有效的作图群体。除拟南芥外，其它自交物种大多表现出较高的连锁不平衡水平，如大豆的连锁不平衡大于50kb[40];栽培高粱的连锁不平衡大于15kb[41];水稻的Xa位点连锁不平衡可以达到100kb以上[42]。
与大多数自交物种相比，异交物种的连锁不平衡程度则要低得多。例如，玉米的1号染色体的体连锁不平衡衰退十分迅速，大约200bp距离就变得十分微弱[24]，但是在特定的玉米群体如遗传狭窄的群体或者特定基因位点如受到人工选择的位点，连锁不平衡水平会有所增强[43~46]。野生向日葵中，连锁不平衡超过200bp的距离就很难检测到(r=0.10)，而栽培向日葵群体连锁不平衡程度则可能够达到约1100bp的距离(r=0.10)[26]。马铃薯的连锁不平衡在短距离内下降迅速(1kb降到r2=0.2左右)，但在1Kb以外下降却十分缓慢(10cM降到r2=0.1)[27]。此外，异交繁育类型的森林树种如火矩松、花旗松等同样显示出低水平的连锁不平衡[30，31]。
转贴于2.3基因组重组对DNA多态性的影响
基因组的遗传重组是指二倍体或者多倍体植物或者动物减数分裂时发生的同源染色体之间的交换或者转换[47]。它通过打破遗传连锁而影响群体的DNA多态性式样，其在基因组具体位点发生的概率与该位点的结构有很大的关系，基因组上往往存在重组热点区域，如玉米的bronze(bz)位点，其重组率高于基因组平均水平100倍以上[48];并且重组主要发生在染色体上的基因区域，而不是基因间隔区[49，50]。同时，在基因密度高的染色体区段比基因密度低的染色体区段发生重组的频率也要高得多[41，51];在不同的物种中，基因组重组率平均水平也有很大的差异。如大麦群体基因组的重组率为=7～8×10–3[52]，高于拟南芥(=2×10–4)40倍[27]，但只有玉米(=12～14×10–3)的一半左右[24]。
目前有很多关于重组和DNA多态性之间的相关关系的研究，但是没有得到一致的结论。部分研究显示重组对DNA多态性具有较强的影响。如Tenaillon等[24]研究显示玉米1号染色体的DNA多态性高低与重组率具有较高的相关性(r=0.65，P=0.007)，野生玉米群体、大麦及野生番茄也都存在同样的现象[52~54]。而在拟南芥中，重组对DNA多态性的贡献率就非常低[22]。Schmid等[23]用大量的基因位点对拟南芥群体的核苷酸多态性进行调查后发现:重组率与核苷酸多态性相关关系不显著;Wright等[55]调查了拟南芥1号和2号染色体的6个自然群体序列变异式样，结果显示，在着丝粒附近重组被抑制的染色体区域，核苷酸多态性并没有随之降低。说明了拟南芥基因组的重组率与DNA多态性并没有必然的相关关系。Baudry等[31]对番茄属内5个种进行了比较研究，结果也显示重组对种群间的DNA多态性的影响也不明显。
2.4基因进化方式(中性进化或适应性进化)
分子群体遗传学有两种关于分子进化的观点:一种是新达尔文主义的自然选择学说，认为在适应性进化过程中，自然选择在分子进化起重要作用，突变起着次要的作用。新达尔文主义的主要观点包括:任何自然群体中经常均存在足够的遗传变异，以对付任何选择压力;就功能来说，突变是随机的;进化几乎完全取决于环境变化和自然选择;一个自然群体的遗传结构往往对它生存的环境处于或者接近于最适合状态;在环境没有发生改变的情况下，新突变均是有害的[56]。另一种是日本学者Kimura为代表的中性学说，认为在分子水平上，种内的遗传变异(蛋白质或者DNA序列多态性)为选择中性或者近中性，种内的遗传结构通过注入突变和随机漂变之间的平衡来维持，生物的进化则是通过选择性突变的随机固定(有限群体的随机样本漂移)来实现，即认为遗传漂变是进化的主要原因，选择不占主导地位[2~4]。这两种学说，在实验植物分子群体遗传学的研究中都能得到一定的支持。
对植物基因在种内进化方式的研究主要集中在拟南芥菜、玉米、大麦等农作物及少数森林树种。Wright和Gaut[16]对2005以前发表的相关文章进行详细的统计，结果显示:拟南芥中大约有30%的基因表现为适应性进化;玉米中大约有24%的基因表现为非中性进化;大麦的9个基因中，有4个受到了选择作用的影响。
选择作用主要包括正向选择、平衡选择、背景选择及稳定选择，它们单独或者联合对特定基因的进化方式产生影响。如花旗松中的控制木材质量和冷硬性状的基因[30]、火炬松的耐旱基因[29]、欧洲山杨(Europeanaspen)的食草动物诱导的蛋白酶抑制基因(Herbivore-inducedProteaseInhibitor)等[57]，经检测在各自的群体受到了正向选择、平衡选择、背景选择单独或者多重影响。植物抗性基因(R基因)是研究得比较深入的一类基因，大部分研究结果显示抗性基因具有高度的多态性，并经受了复杂的选择作用[58]。Liu和Burke[26]对栽培大麦和野生大麦群体中9个基因在调查显示其中的8个基因受到稳定选择。Simko等[27]对47份马铃薯66个基因位点调查表明，大部分基因位点在马铃薯群体进化过程中受到了直接选择或者分化选择作用。以上对不同物种的不同基因位点的研究都强调了分子进化的非中性的结果，这说明选择在基因的进化过程中具有非常重要的作用;另一方面，中性进化的结果报道较少，或被有意或者无意地忽略，事实上即使在强调选择作用的研究文献中，仍然有相当一部分基因表现为中性进化，说明在种内微观进化的过程中，选择作用和中性漂变作用可能单独或者联合影响了物种内不同的基因位点，共同促进了物种的进化。
2.5群体遗传分化
分子群体遗传学一个重要的研究内容是阐明物种不同群体之间甚至不同物种群体之间(通常近缘种，如栽培种及其近缘种或祖先野生种)遗传结构的差异即遗传分化，并推测形成这种差异的原因，从而使人能够更好地理解种群动态。
植物种内不同群体间遗传分化的研究案例有很多，典型的有:(1)拟南芥全球范围内的遗传分化。Kawabe和Miyashita[59]利用碱性几丁质酶A(ChiA)、碱性几丁质酶B(ChiB)及乙醇脱氢酶(Ahd)3个基因对拟南芥进行群体亚结构的分析，结果只有ChiB显示出一定的群体亚结构，而ChiA、Ahd的系统学聚类与样本地理来源之间没有表现出任何相关关系，这样的结果暗示了拟南芥近期在全球范围内经历了迅速扩张。Aguade[60]和Mauricio等[61]分别用不同的基因、Schmid等[23]用多基因位点进行的拟南芥分子群体遗传学研究也支持同样的结论。(2)森林树种的遗传分化。Ingvarsson等[62]发现欧洲山杨的日长诱导发芽的侯选基因(phyB)变异方式呈现出纬度渐变方式，表明欧洲山杨出现了明显的适应性分化;Ingvarsson等[63]对多个基因单倍型地理格局分布的研究同样发现欧洲杨具有明显的地理遗传分化。但是研究表明花旗松(Pseudotsugamenziesii)[30]、火炬松(Pinustaeda)[29]、圆球柳杉(Cryptomeriajaponica)等[64]等物种没有发生明显遗传多样性的地理分化。
植物不同物种间遗传分化的研究主要集中对在栽培种及其野生近缘种的DNA多态性的比较上。由于早期的驯化瓶颈及人工选择繁育等遗传漂变作用结果[65]。栽培物种的遗传多样性通常都低于他们的野生祖先种。Hamblin等[28]利用AFLP结果筛选得到基因片段的DNA多态性，对栽培高粱(S.bicolor)和野生高粱(S.propinquum)进行了比较研究，结果表明:野生高粱的平均核苷酸多态性大约为0.012()，大约是栽培高粱的4倍。Liu等[26]的研究显示:野生向日葵中，核苷酸多态性达到0.0128()、0.0144(W)，显著高于栽培向日葵的0.0056()、0.0072(W)。Eyre-Walker等[66]对栽培和野生玉米Adh1基因大约1400bp的序列研究表明:栽培玉米的遗传多样性大约只有野生玉米种(Zeamayssubsp.parviglumis)的75%。Hyten等[67]的研究显示野大豆的平均核苷酸多态性为0.0217()、0.0235(W)，地方种则分别为0.0143()、0.0115(W)，大约为野大豆的66%()和49%()。以上结果充分反应了栽培物种驯化过程中曾遭受过瓶颈效应。
3分子系统地理学
分子系统地理学是在分子群体遗传学的基础上，衍生出的新学科分支。早在20世纪的60年代，Malecot[68]就发现了基因的同一性随地理距离增加而减少的现象;1975年Nei的《分子群体遗传学和进化》一书中也提到在描述群体的遗传结构时要重视基因或者基因型的地理分布[1];1987年Avise等[17]提出了系统地理学概念。在植物方面，分子地理系统学研究取得很多重要的成果。如对第四世纪冰期植物避难所的推测及冰期后物种的扩散及重新定居等历史事件的阐释，其中最为典型的研究是对欧洲大陆冰期植物避难所的确定及冰期后植物的重新定居欧洲大陆的历史事件的重现。如欧洲的栎属植物的cpDNA的单倍型的地理分布格局表明，栎属植物冰期避难所位于巴尔干半岛、伊比利亚岛和意大利亚平宁半岛，现今的分布格局是由于不同冰期避难所迁出形成的[69]。King和Ferris[70]推测欧洲北部的大部分欧洲桤木种群是从喀尔巴阡山脉这个冰期避难所迁移后演化形成的。Sinclair等[71，72]推测欧洲赤松在第四纪冰期时的避难所可能是在爱尔兰岛或者在法国的西部。此外，分子系统地理学在阐明了一些栽培作物的驯化历史事件如驯化发生的次数及驯化起源地等方面也取得了重要的进展。如Olsen等[73]对木薯(Manihotesculenta)单拷贝核基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase)在木薯群体中单倍型的地理分布方式深入调查后推测:栽培木薯起源于亚马逊河流域南部边界区域。Caicedo等[74]利用核基因果实液泡转化酶(fruitvacuolarinvertase)的序列变异阐明了栽培番茄(Lycopersiconesculentum)的野生近缘种(Solanumpimpinellifolium)的种群扩张历史，基因变异的地理分布方式表明栽培番茄起源于秘鲁北部，然后逐步向太平洋岸边扩张。Londo等[75]利用一个叶绿体基因和两个核基因的变异对两个亚洲的栽培籼、粳亚种及其近缘野生种进行了系统地理学研究，阐明了籼、粳稻分别起源于不同的亚洲野生稻(O.rufipogon)群体，其中籼稻起源于喜马拉雅山脉的南部的印度东部、缅甸、泰国一带，而粳稻则驯化于中国南部，等等。
分子遗传学研究方法篇6
关键词：辣椒；种质资源；分子标记
辣椒是我国主要蔬菜作物之一，栽培面积仅次于白菜。辣椒杂交优势的开发和推广，使品种遗传资源日渐狭窄，加强对辣椒属种质资源的研究，拓宽辣椒遗传渠道，对促进辣椒遗传改良有重要意义。在种质资源研究领域，以分子标记为基础的研究逐渐占据主导地位。
1分子标记的优越性及主要方法
DNA分子标记技术主要是基于由单碱基突变和易位、插入、缺失、倒位或转座等导致的DNA序列变异来研究多态性。其优越性包括：不受环境及基因是否表达的限制；遍及整个基因组，数量极大；对生物体无不良影响；多数表现为共显性，可分辨所有的基因型。
自1980年Botstein首次利用RFLP标记作为遗传标记开始，迄今已开发出了一系列的分子标记方法。用于遗传多样性研究的可分为四大类：（1）基于Sourthern杂交的DNA标记，如RFLP等；（2）基于PCR的DNA标记，如SSR等；（3）基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记，如AFLP等；（4）基于单核苷酸多态性的DNA标记，如SNP等。
2分子标记在辣椒种质资源研究上的应用
2.1RFLP标记的应用及评价
RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）是Grodzicker等发明的分子标记技术，其检测和显示通过不同的探针与酶组合来实现。用已克隆的DN段作探针与Southern印迹后酶切DNA样品分子杂交，经放射自显影或非同位素显色来揭示供试样品间的多态性。
Tanksley（1988）、Prince（1993）等构建辣椒分子遗传图谱时，RFLP标记技术在辣椒中得以应用。在国内，中国农科院蔬菜花卉研究所的张玉玺等曾采用RFLP技术对辣椒种质资源分类展开过研究。
RFLP标记具有数量大、稳定遗传、重复性好、共显性等优点。作为第一代分子标记深受重视并广泛应用。但其操作过程较繁琐，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性Southern杂交技术也较为耗时费力。
2.2RAPD标记的应用及评价
RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）是建立在PCR基础上可对整个未知序列基因组进行多态性检测的分子技术，由Welsh等和Wil-liams等发明。
雷进生从100条随机引物中筛选出19条用于RAPD标记，通过聚类分析把67份辣椒种质材料划分为4类[1]。马艳青等利用RAPD技术，对来自不同生态类型的辣椒种质资源亲缘关系进行研究，聚类结果表明，DNA分子水平上辣椒亲缘关系与传统方法研究结论基本一致[2]。陈学军用23条RAPD引物共扩增出209条带，证实：C.annuum与C.frutescens、C.chinense亲缘关系较近，而与C.pubescens、C.baccatum亲缘关系较远[3]，与细胞学研究结果一致。蒋向辉等运用形态标记与RAPD标记对7份朝天椒种质资源进行遗传多样性分析，两种方法聚类分析结果相似[4]。
RAPD标记操作简便，避免了RFLP技术繁琐的Southern杂交操作以及放射性同位素给人带来的危害；可同时检测多个基因位点，且可检测RFLP标记不能检测的重复序列区域。不足之处为：一般表现为显性遗传，所提供的信息量不完整且重复性较差。RAPD标记在早期运用较多，现已逐渐被取代。
2.3SSR标记的应用及评价
SSR（SimpleSequenceRepeat）最早由Litt等人在1989年建立。罗玉娣等利用27对SSR引物对33个辣椒材料进行遗传多样性分析，聚类结果显示，辣椒果实类型一致的种质资源基本都聚在一起，即它们之间的亲缘关系较近[5]，这与周晶的研究结果一致。白占兵等人从150对辣椒SSR引物中筛选出多态性较好的引物116对，初步建立了基于SSR分子标记技术的辣椒种子纯度鉴定体系。中国农科院蔬菜花卉研究所辣椒育种课题组Huang等利用生物信息学的方法新开发出辣椒的SSR引物400多对[6]。
由于SSR技术可揭示完整遗传信息，呈现共显性遗传、结果稳定可靠、重复性好、简便易行，且数量极为丰富，分布于整个基因组；多态性高，等位位点多，因此信息含量极为丰富；这些优点使其成为理想的分子标记并取代RFLP而成为被广泛应用的第二代DNA分子标记。其不足在于引物开发较复杂，引物的设计需要建立、筛选基因组文库和克隆测序等一系列实验，较费时费力。
2.4SRAP标记的应用及评价
SRAP（Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism）2001年由加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士开发。杜晓华用SRAP和SSR标记技术分析10份尖椒自交系的遗传差异，结果显示SRAP技术有较高的位点和多态性检测能力，分别是SSR的10倍和5倍[7]。张素勤等用表型和SRAP分析对贵州主栽辣椒品种进行研究以探讨其亲缘关系和多样性分布。聚类结果表明，地理分布相近的基本被聚在一起[8]。许先松等人采用形态学标记与SRAP技术，分别对49和72份辣椒资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析。结果表明，形态学标记与SRAP分子标记结果有较大的出入，证实SRAP作为分子标记的结果不受环境影响，所揭示的种质资源遗传多样性更为丰富[9]。
SRAP标记多态性高、简便、稳定，在基因组中分布均匀、中等产率、引物通用，且其正向引物可以与反向引物两两配对组合，它对开放阅读框进行扩增，可应用于不同作物的遗传图谱构建、图位克隆、基因组和基因定位等。该技术在分子标记辅助育种中是最有可能被大规模进行实际应用的一种技术，在遗传育种有着广泛的应用前景。
2.5AFLP技术的应用及评价
AFLP（Amplifiedfrgmenilentlengthpolymorphism）是一种通过对DNA限制性片段的选择性扩增来检测多态性的一种DNA指纹技术。1993年由荷兰Zabeau等人发展起来，并获欧洲专利局专利。
宋晓丽用AFLP分子标记与表型性状对辣椒12个品种聚类分析结果显示，两种分析结果达到显著性正相关[10]。刘科伟等建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。贺洁等人对22份朝天椒材料利用AFLP技术进行遗传多样性分析。结果显示，9对AFLP引物扩增出97条为多态性条带，22份材料被聚成三大类[11]。
该技术可靠性高且灵敏，不需要Southern杂交、不需要预知DNA的序列信息，多态性很少、待测样品较少时能达到理想效果。但对酶切用的DNA模板质量要求高，工作量大，操作难度较高，步骤复杂，费用高，加上该技术已申请专利，使其广泛应用受到限制。
2.6ISSR标记的应用评价
ISSR（intersimplesequencerepeat）是Zietkeiwitcz等于1994年在SSR基础上发展起来的一种标记。
陈学军等用RAPD、ISSR分子标记及28个表型性状数据对辣椒属5个栽培种的13份材料进行了分析，结果显示，与RAPD相比ISSR标记检测到的遗传离散度、有效等位基因数和遗传分化系数等参数都较大，说明ISSR有更高的多态性检测效率，且适合亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析[12]。
ISSR标记在保留SSR检测技术优点的同时，克服了其开发困难的不足。在亲缘关系分析、遗传多样性研究、基因定位等方面得到较多应用。其引物种特异性不强，可在不同的物种间通用；ISSR可获得几倍于RAPD的信息量，精确度可与RFLP相媲美，检测也更方便，是较有发展前途的分子标记。
2.6其它方法
SCAR标记（sequence-characterizedamplifiedregion），SCAR标记由于所用引物较长及引物序列与模板DNA完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好，可重复性强。它们在分子标记辅助育种方面发挥重大作用
STS标记（sequence-taggedsite），是指长度200～500bp的序列已知的单拷贝序列，可用STS位点两端的一对长约20bp的特异引物进行专一性扩增。由于STS在基因组中出现一次，在染色体上位置固定，所以可作为界定基因组中染色体片段位置的位标。STS在人类基因组计划、水稻基因组计划的遗传图绘制中发挥较大作用。
3讨论
不同标记方法尤其是分子标记与表型标记间相结合的研究方式逐渐成为研究者的共识，其研究结果相互印证增强了说服力，并为普通辣椒育种者提供直观便捷且科学的依据。
在分子标记技术的发展中，由于SNPs（singlenucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性）检测与分析技术的飞速发展，特别是与DNA微阵列和芯片技术相结合，使其迅速成为最有前途的第三代分子标记。基于SNP发展起来的分子标记技术，除SCAR外还包括CAPS标记、dCAPS标记等，这些技术已在辣椒的遗传图谱、遗传定位和辅助育种得以应用。利用该技术对辣椒种质资源展开更科学严谨的研究是国内辣椒种质资源的发展趋势。
（收稿：2013-04-10）
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