简述克隆培养法的基本原理(6篇)
简述克隆培养法的基本原理篇1
关键词：HBVX蛋白：真核表达；乙型肝炎病毒：细胞模型
中图分类号：R575.3文献标识码：A文章编号：1007-7847(2007)04-0355-06
乙型肝炎病毒X基因(HBVX)及其编码的多功能蛋白(HBX)在乙肝相关的肝细胞癌(HCC)发生发展中起着重要的作用。但关于HBX能否直接转化肝细胞一直存在着争议，其原因之一可能是缺乏合适的体外模型，我们以人源性永生化非瘤性肝细胞株OSG7701为靶细胞，将HBvX导人OSC7701细胞，建立表达HBX蛋白的肝细胞模型，为探讨HBX在HBV相关HCC的发生发展过程中的作用提供一个有价值的平台。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1载体、菌株及细胞株
pGEM-TEasyVector为美国homeCa公司产品，真核表达质粒pRc/CMV2购自Sigma公司，E.coliDH5a及人源性肝细胞株QSG7701，为本实验室保存。
1．1．2主要试剂
TaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTP为日本Takara公司产品：血清HBV裂解缓冲液为上海申友生物公司产品：快速连接试剂盒、限制性内切酶ApaI和HindⅢ及DNA分子量Marker均为BBI公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒、TRANSfection转染试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒均为北京TIANGEN生物技术公司产品；胎牛血清购自杭州赛乐生物公司：高糖DMEM为美国GIBCO公司产品：G418、蛋白分子量Marker为上海生工生物工程公司产品；Trizol为美国MRC公司产品：逆转录试剂盒为Fermentas公司产品；鼠抗人HBX单克隆抗体为德国abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、硝酸纤维素膜为ProMab公司产品：蛋白质抽提试剂盒、ECL化学发光试剂盒均为PIERCE公司产品。
1．1．3引物
针对人HBVX基因序列的PCR引物由于akara公司合成，引物源于已发表的序列，正义5'-AAAGCTTCCATGGCTGCTCGGGGTTG-3'：反义5'-AGGGCCCTTAGGCAGAGGTGAAAAAG-3'(正义链含有HindⅢ酶切位点和起始密码子，反义链含ApaI酶切位点和终止密码子)，目的片断大小为481bp.人β-actin，actin引物由北京鼎国生物公司合成，正义5'-TAACTGGAACGGTGAAGGTG-3'：反义5'-AGGGCACGAAGGGGCTCATCAT-3'，目的片断大小为316bp。
1．2方法
1．2．1HBVX基因的扩增与克隆
采乙肝患者静脉血(经湘雅医院感染病科实验室检测乙肝三项定量示：HbsAg阳性，HbeAg阳性，ttbcAb阳性)，以碱裂解法提取DNA，以此为模板，扩增HBVX基因片断，反应体系为25μL，其中含模板DNA3μL，dNTP1μL，上下游引物2μL，TaqDNApolymeraselμL，扩增条件为95℃5min，94℃50s，57℃50s，72℃1min，共扩增35个循环，最后72℃8min，用1.0％低熔点琼脂糖凝胶分离PCR产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片断，与pGEM-了载体连接，连接产物命名为pGEM/X，转化感受态细菌E.coliDH5a，Amp的LB/X-gal选择性培养基筛选白色菌落，增菌后碱裂解小量抽提法提取质粒，ApaI/HindⅢ双酶切鉴定。
1．2．2真核表达质粒pCMV/X的构建及鉴定
小量提取真核表达载体pRc/CMV2及重组质粒pGEM/X，分别用ApoI和HindⅢ双酶切，X基因及质粒载体均用1.0％琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收试剂盒回收纯化。用快速连接试剂盒进行连接，连接产物命名为pCMV/X，转化DH5a感受态细菌，挑取阳性单菌落，增菌并提取质粒，ApaI/HindⅢ双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司测序。
1．2．3QSG7701细胞的培养及稳定转染
QSG7701细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％V/VC02培养箱中培养，待细胞生长至约85％的融合状态进行传代，按TRANSfection转染试剂盒提供的方法，以质粒pRc/CMV2及pCMV/X，分别转染QSG7701，实验分3组，分别为QSG7701细胞未转染组：QSG7701转染pRc/CMV2组(简称pRcCMV2/QSG)，QSG7701细胞转染重组质粒pCMV/X组(简称pCMVX/QSG)，细胞转染质粒4d后，在3组细胞的完全培养基中加入G418筛选，前2dG418浓度为200mg/L，然后将G418加量为400mg/L，共筛选2周，隔天换液，直至未转染质粒的阴性对照组全部死亡，而转染组的细胞有抗性克隆出现，以200mg/LG418维持筛选20d，然后挑取单个克隆扩大培养，建立稳定转染的细胞系，即pCMVX/QSG和pRcCMV2/QSG细胞系。
1．2．4转染细胞中目的基因DNA的鉴定
用细胞基因组DNA提取试剂盒提取转染细胞中的基因DNA，PCR法扩增鉴定HBVX基因。
1．2．5转染细胞的总RNA的提取及PT-PCR鉴定
采用Trizol试剂提取转染细胞中的总RNA。通过RT-PCR扩增HBVXmRNA基因。
1．2．6表达产物的Westernblottin~鉴定
在冰上按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞蛋白质，加入适量2XSDS凝胶加样缓冲液(50mmol/LTrisHCl，pH6.8；100mmol/LDTT：2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％甘油)，100℃煮沸3min，使蛋白质变性，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶+100mLPBS)中室温封闭1h，分别加入特异性HBX抗体(1:50)和
GAPDH抗体(1:2000)，37℃水平摇床孵育1h，4℃过夜，PBS充分洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的相应的二抗。即猴抗羊IgG(1:1000)和羊抗鼠IgG(1:1000)，37℃水平摇床孵育2h，充分洗涤后，化学发光试剂(ECL)A液和B液混合后加至硝酸纤维素膜上，暗示曝光3～5min，取出X光片，显影，定影观察结果。
2结果与分析
2．1PCR扩增血清中I-IBVX基因片断
以HBV感染者的血清DNA为模板，扩增出HBVX基因片段，琼脂糖凝胶电泳，目的条带出现在500bp左右的位置，与预计的481bp相符，阴性对照组是以正常人血清中提取的DNA为模板，未扩增出目的片断，见图1表明通过PCR方法已从HBV感染者血清中成功扩增出HBVX基因片段，为下一步基因克隆打下了基础。
2．2重组质粒pGEM/X阳性克隆的筛选及鉴定
PCR产物与pGEM-T载体连接，转化感受态细菌，挑选白色菌落，增菌提取质粒，质粒经ApaI/HindⅢ双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，于500bp左右可见一清晰的条带，与预计的481bp相符，表明经PCR扩增的X基因片段已成功克隆人pGEM-T载体中，见图2。
2．3重组表达质粒pCMV/X的筛选及鉴定
重组表达质粒pCMV/X经ApaI/HindⅢ双酶切后，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，可见大小两条清晰的条带，小分子条带位于500bp左右，与HBVX基因的大小相符，表明重组表达质粒pCMV/X的构建是成功的，见图3。
2．4重组表达质粒pCMV/X测序鉴定
重组表达质粒pCMV/X测序报告所示目的片段序列与GenBank上AYl230HBVX基因序列一致，测序引物为T7，从第10位至478位碱基为目的片段，见图4，上述结果进一步证实已成功构建了重组表达质粒pCMV/X。
2．5G418筛选转染细胞及克隆形成
质粒pCMV/X和pRc/CMV2分别转染QSG7701细胞后，经G418筛选2周后。作为阴性对照的未转染的QSG7701细胞全部死亡，转染细胞组有抗性细胞克隆出现，分别获得pCMVX/QSG细胞阳性克隆8个，pRcCMV2/QSG细胞阳性克隆6个，转染后的细胞在倒置显微镜下观察细胞形态与正常QSG7701细胞相比无明显变化，仍表现出上皮样细胞的特点，为扁平的多角形细胞，见图5.200mg/LG418维持筛选的过程中，发现细胞克隆逐渐增多，增大，肉眼观察可见白色的细胞克隆，pCMVX/QSG组共25个，pRcCMV2/QSG组共19个，上述结果表明。重组表达质粒pCMV/X及质粒pRc/CMV2已分别稳定转染QSG7701细胞，并已分别获得相应细胞克隆。
2．6转染细胞中HBVX基因鉴定
pCMVX/QSG细胞DNA经PCR扩增后，在500bp下方出现一特异性条带，与预期片段大小481bp一致，电泳条带清晰，无杂带，无拖尾，而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞DNA经PCR扩增后均未见特异性片段，见图6，结果表明重组质粒pCMVX转染的QSG7701细胞中包含目的基因片段HBVX。
2．7RT-PCR检测转染细胞中HBVXmRNA的表达
从3种细胞中提取细胞总RNA，分别进行RT-PCR扩增反应，结果显示pCMVX/QSG组在500bp附近出现清晰的条带，与预期的481bp吻合。而pRcCMV2/QSG及QSG7701组无目的条带出现，表明在pCMVX/QSG细胞中存在HBVX转录产物的表达，见图7，结果表明重组质粒pCMVX转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBVXmRNA。
2．8WesternBlotting检测转染细胞中HBX的表达
pRcX/QSG细胞提取蛋白在分子质量约17kD处可检测到特异性蛋白条带，与HBVX蛋白的理论分子质量是一致的。而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞抽提蛋白则未见HBVX蛋白表达，见图8，结果表明重组质粒pCMVX转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBVX蛋白。
3讨论
在HBV编码的蛋白质中，HBX是一种由154个氨基酸残基组成的多功能蛋白，大量研究表明，即使HBX对HBV的感染不是绝对必须的，它也至少在HBV的复制中起着关键的作用，因而HBX与HBV的生命周期、致病机制甚至HCC的发生发展密切相关，HBX具有广泛的反式激活功能，它虽然不能与DNA直接接合，但可以通过蛋白，蛋白相互作用，激活多种信号传导通路(如FasL/Fas、JAK/STAT、Ras/Raf和JNK传导通路等)，来调节各种信号蛋白及原癌基因的表达，而这些蛋白常参与细胞增殖、有丝分裂、分化及恶性转化等生理病理过程，HBX长期缓慢激活信号传导途径，类似于弱的肿瘤促进剂，这已成为HBX致癌的热点机制。
目前，关于HBX在HBV感染及HCC发生发展中所起的确切作用仍存在很大争议，许多研究结果甚至相互矛盾，在HBX漫长的致癌过程中，有许多因素在不同阶段参与作用，全面研究HBX生物学特性，将有助于揭示HBV相关HCC的发生和发展机制，为了进一步探讨HBX在HCC发生过程中所起的作用及其确切的分子机制，建立恰当的细胞、动物模型是至关重要的，然而，在转基因的肝细胞模型中，大多是以人或鼠肝癌细胞如HepG2、HepG2.2.15、QGY7701、Huh7等为研究对象，来探讨HBX在肝癌细胞的凋亡、分化与增殖中的信号传导通路，以及细胞癌基因的激活等方面所起的作用，而对HBVX基因及HBX蛋白对非瘤性肝细胞的影响研究甚少，HBX能否转化正常肝细胞甚至瘤性转化正常肝细胞?目前在这方面的报导极少。
因此，本研究选用了人源性非瘤性肝细胞QSG7701为研究对象。将含全长HBVX基因的真核重组表达质粒pCMV/X转染QSG7701细胞，建立HBVX稳定转染的肝细胞模型，以探讨HBX对正常人肝细胞的转化作用，首先，HBVX真核表达质粒构建的成功与否，关系到细胞模型中HBX的表达，直接影响到实验的结果，也是目前关于HBX的研究结果出现分歧的原因之一，本实验中。我们选用的真核表达载体为pRc/CMV2，在其强大的启动子SV40和CMV的作用下，HBVX基因在转染细胞中实现了高水平的转录和表达，为建立理想的细胞模型打下了基础。
在扩增HBV感染者血清中HBVX基因的引物设计及选择方面，我们考虑到HBV共有8种基因型(A-H)，基因型的差异可以引起HBX氨基酸的差异。而这些差异可导致HBX反式激活功能的不同，至于是否会导致不同的临床及病理表现，目前还不确定，亚洲地区HBV主要基因型为B型和C型，而中国人以adr亚型为主，故我们扩增HBVX的引物设计是针对adr亚型HBVX的基因序列，并成功地从“大三阳”且HBVDNA阳性患者的血清中扩增出目的HBVX片段，真核重组表达质粒pCMV/X测序目的基因，其结果与PubmedGenBank中adr亚型的HBV又序列吻合。
简述克隆培养法的基本原理篇2
关键词小麦；MYB基因；表达
中图分类号S512.1文献标识码A文章编号1007-5739（2014）01-0029-01
干旱、盐碱和极端的温度等非生物胁迫严重影响小麦的分布和产量，提高小麦对非生物胁迫的耐受性已经成为小麦育种的主要目标。利用转基因的方法，将一些优良的抗逆基因转化小麦，是提高小麦抗逆能力的一个主要方法。
MYB转录因子在应答非生物胁迫中具有重要作用，例如TaMyb2-Ⅱ基因受干旱胁迫诱导表达[1-2]。TaMYB32基因受高盐胁迫诱导[3]。在前期克隆小麦MYB基因的基础上[4]，分析在小麦不同组织中MYB基因的表达情况，为进一步研究基因的功能奠定试验基础。
1材料与方法
1.1试验材料
挑选大小均匀的小麦种子30粒，用75%的酒精消毒1min，用无菌水冲洗后，置于培养皿中，加入去离子水。在光照培养箱中20℃培养，生长20d后，取根、茎和叶片，经液氮速冻后，于-70℃保存备用[5]。
1.2试验方法
用TRIZOL试剂盒（TIANGENG）提取根、茎、叶组织的总RNA。利用AMV反转录酶（TaKaRa）发转录合成cDNA第1链。以分别转录的根、茎和叶组织总RNA为模板进行RT-PCR，RT-PCR反应体系和程序参见于月华等[4]。
采用半定量RT-PCR方法，以小麦的根、茎和叶组织cDNA第一链为模板，检测MYB基因在3种组织中的表达情况。扩增引物为：F：5′-AACGCCGTCAAGAATCACT-3′和R：5′-GAAGAAACCGCCACCACTA-3′。以小麦actin基因为内参基因[1]。扩增体系为20uL，扩增程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s60℃复性45s72℃延伸1min，28个循环，72℃延伸10min[6]。
2结果与分析
利用半定量RT-PCR，分析在小麦根、茎和叶组织中MYB基因的表达特性。结果表明，该基因在上述3种组织中均有表达（图1）。利用QuantityOne软件对电泳结果进行定量分析，表达量大小依次为根、茎和叶。
3结论与讨论
在不同的组织中，小麦MYB基因的表达呈现组织特异性表达和组成型表达2种模式[7]。例如，半定量RT-PCR分析发现TaMYB32基因的转录本在根、茎、叶、雌蕊及花药中均有很强的表达，在上述组织中呈现组成型表达模式[3]。在茎和根组织中，TaMYB4表达量高，但是在叶组织不表达，表达具有一定的组织特异性。
研究结果表明，在小麦根、茎和叶组织中MYB基因的表达量并不相同，在根中表达量最高，在叶片中表达量最低。小麦MYB基因在这些组织中具体参与哪些生理和发育过程仍需进一步研究确定[8-13]。
4参考文献
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基金项目新疆维吾尔自治区高校科研启动项目（XJEDU2011S20）；新疆农业大学大学生创新项目（项目编号：jqzyp42011012）；新疆农业大学校前期资助课题（XJAU201019）；作物遗传育种重点学科资助项目。
作者简介梁小莉（1991-），女，新疆奎屯人，在读本科生。研究方向：小麦遗传育种。
简述克隆培养法的基本原理篇3
一、创设问题情境、为课堂互动打好基础
创设良好的问题情境能有效地激发并维持学生的学习兴趣，为课堂教学创设了一种紧张、活跃、和谐、生动、张驰有效的理想气氛。教师在提出问题时要考虑：
1、根据本节课的教学目标，提出相应的问题。教师针对教材中的知识点设计出疑问（能反映本课的教学目标、知识重点），使学生清晰地知道一节课内学什么，怎么学，学好了有什么意义，使学生的无意注意向有意注意转化，促进学生自主学习时的积极思维。从而激起他们的学习兴趣，有助于学生对教学内容全面深入地理解。
2、要贴近学生的生活实际。学生在生活中能够遇到但不能用已有的知识去解答的问题，最能吸引学生的注意力，产生立刻要想知道的欲望，如我们吃的西瓜有些有籽有些无籽为何的问题激发学生的质疑心理。
3、提出问题，强化学生的注意利用学生熟知的生活常识设计问题情境，引导学生去思考，利于学生分析、思维等能力的培养和注意力的集中。首先问学生发面都有哪些方法呢？学生能列举出如小苏打法、物理打泡法及酵母菌发酵法等。接着教师提出：什么叫发面呢？引导学生了解发面就是使面中充有气体，加热时气体膨胀，使面松软。再通过复习植物的呼吸作用，引出酵母菌的两种呼吸方式及酵母发面的原理。利用酵母菌在无氧条件下发酵能产生酒精的知识，向学生介绍工业上酿酒的方法以及轰动一时的山西假酒案发生的原因及严重后果。通过向学生介绍有关甲醇与乙醇在物理特性方面的关系，教育学生要做品德高尚的人，不做损人利已的事。再通过敞口的广口瓶和盖严的广口瓶中的酵母菌培养液在气味上的区别，使学生进一步了解酵母菌的呼吸方式。
二、贴近生活，联系社会，培养兴趣
1.彰显“生活化”教师从学生已有生活经验出发，把生物问题与学生已有生活经验紧密联系起来。这样一方面培养学生学习兴趣，使学生爱学，乐学。另一方面由于提问的内容贴近学生的生活实际，符合学生奇特的想象，学生学习时易于理解和接受。譬如，在教学“生物基本特征”时，我从学生熟悉的身边事物入手，即课堂准备了“树叶、石头、鸡毛、蚂蚁、菜豆种子……等”并把这些摆放在各小组同学面前，这样既有利于学生凭借生活经验主动思考，实现生活经验生物化，又有利于让学生感受到生物就在身边，学会用生物的眼光看待、分析、解决生活中的问题，培养了学生的生物应用意识和探索精神，体现了“生物源于生活，又作用于生活”的理念。2.联系社会热点热点问题最富吸引力，选择热点问题，有利于开拓学生视野，活跃学生思维。例如：在讲述“无性生殖”时，联系“克隆羊”技术，简介“克隆人”的情况，继1997年克隆羊“多利”引起科学界的轰动后，1998年初，美国科学家理查德·度德宣布一项克隆计划，表示要在短期内“制造”出第一个克隆人，并打算将生产过程企业化，最终目标是在美国国内及海外设置多个复制诊所。此举引起了全世界对克隆技术的关注和讨论，各国政府及科学家们都对此项计划进行了批驳。为什么大家都要反对“克隆人计划”呢？引导学生从这一技术发展对人类文明和希望的困扰与威胁，从人类社会伦理道德等方面进行讨论，使学生对无性繁殖的概念及无性繁殖技术的发展有了进一步的认识。这样，既活化了课堂教学，又进一步培养了学生学习生物的兴趣。三、采用灵活多变的教学方法1、巧用比喻化疑难细胞膜的结构像花生糕：花生米像蛋白质分子，爆米花像磷脂分子，花生米以不同的深度覆盖、镶嵌或贯穿于其中。糖类和ATP比喻成家里的粮食和口袋里的现金。高温和低温对酶的影响比喻成人死了和睡着了。
2、用比较法综合复习课本中有2个“基本”、3个“基础”、4种能源极易混淆，如何区分它们呢？我把它们找出来，排在一起，加以比较，学生一目了然。2个基本是：新陈代谢是生命的最基本特征，光合作用是生物界最基本的物质代谢和能量代谢；3个基础是：新陈代谢是生物体进行一切生命活动的基础，构成细胞的元素和化合物是生命活动的物质基础，细胞分裂是生物体生长发育繁殖的基础；4种能源是：主要能源-糖类，储备能源-脂肪，直接能源-ATP，最终能源-光能。
3、利用多媒体创设教学情境多媒体可以用形象生动的画面和美妙的声音，直观的展现抽象文字所表达的内容，让学生在轻松愉快的氛围中学习知识。生活中常见的新闻报道、图片、音像资料等素材都能够用于创设生物教学情境。多媒体技术可极大的吸引学生注意力，调动学生积极性，激发学习热情。
四、激发好奇心，发展兴趣
简述克隆培养法的基本原理篇4
【摘要】目的?：制备重组创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)鼠源性单克隆抗体，并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定，为创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC，将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株，有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型，ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后，经ELISA检测，血清有效稀释度达1:12?800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为B2C7和E3F4株，其抗体类型均为IgG1，且具有较高特异性，与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠，获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，抗体类型为IgG1型。
【关键词】创伤弧菌;溶细胞素;vvhA基因;杂交瘤;单克隆抗体
Abstract:?Objective:Mouse-originalmonoclonalantibodyagainstrecombinantVibriovulnificuscytolysin(rVVC)waspreparedanditsspecificityandtypeofimmunoglobulinwereidentified，?whichcanlayafoundationforthefurtherstudyofVibriovulnificuscytolysin(VVC)pathogenesisandthedevelopmentofrapiddetectionkitofVibriovulnificuscytolysin.Methods:?IPTGwasusedtoinduceE.coliBL21(DE3)?pET28a(+)-vvhAtoexpressrVVC.TherVVCwhichpurificated，refoldedandthendetoxi-fiedwasusedtoimmuneBALB/c.TheeffectsofexpressionandpurificationofrVVCweredeterminedbySDS-PAGE.Thehybridomacelllinestosecreteanti-rVVCmonoclonalantibodieswerepreparedandscreenedbyhybridomatechniqueandELISA，andthenwereclonedwithlimiteddilution.Doubleimmunodiffusionassaywasusedtoidentifythetypeandsubclassofmonoclonalantibody.ELISAanddoubleimmunodiffusionassaywereusedtodeterminethespecificity.Results:?ThemiceimmunizedbyrVVCwhichhadbeenpurified，refoldedanddetoxifiedshowedthehighestserumdilutionto1:12?800byELISA.Twocelllinesofhybridomawerescreenedout，?andcellsofB2C7andE3F4werefoundtobecontinuouslysecretingIgG1monoclonalantibodies.Themonoclonalantibodiesshowedhighspecificity，anddidn’treactwiththeproteinsfromotherbacteria.Conclusion:?BALB/cmiceissuccessfullyimmunizedandtwomouse-originhybridomacelllinesnamedB2C7andE3F4whichcontinuallyandsteadilysecretedspecificmonoclonalantibodiesagainstrVVCareacquired.ThetypeofmonoclonalantibodyagainstrVVCisIgG1.
Keywords:?Vibriovulnificus;cytolysin;vvhAgene;hybridoma;monoclonalantibody
创伤弧菌(Vibriovulnificus，Vv)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，主要存在于海水及海产品中，可引起原发性败血症和严重的创口感染[1-2]。近几年，浙江沿海、深圳也时有报道该菌感染病例，已引起很多专家学者关注。创伤弧菌可能包含诸多毒力因子[3]，溶细胞素是其唯一分泌至胞外具有种特异性的膜成孔类外毒素[4]，可作用于多种靶细胞诱导细胞凋亡、坏死，引起细胞炎症反应等[5-6]。此外，体外重组的创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)亦具有典型的细胞毒活性，能引起人ECV304细胞凋亡[7]，诱导人SMMC7721细胞产生细胞应激，上调其TNF-α和HSP90的表达[8]。目前，有关创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)抗体的研究较少，姚蔚等[9]曾利用体外rVVC制备了其多克隆抗体，并证实该多抗能阻断rVVC对SMMC7721的细胞毒作用，为保护性抗体。而单克隆抗体相比多克隆抗体，具有更高的特异性。因此，本研究中，我们采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化原核表达的rVVC，采用杂交瘤技术制备鼠源性rVVC单克隆抗体并进行免疫学鉴定，以期为VVC致病机制的深入研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素的快速检测试剂盒研发奠定基础。
1??材料和方法
1.1??材料
1.1.1??细胞系、菌种及质粒：小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。E.coliBL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本实验室构建完成及保存。
1.1.2??实验动物：清洁级雌性6周龄BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心(上海斯莱克实验动物有限公司)，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。
1.1.3??主要试剂：Ni2+-NTA亲和层析树脂购自上海申能生物科技有限公司。异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自宝生物工程(大连)有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、盐酸胍及精氨酸购自BBI公司。HRP标记羊抗小鼠IgG、TMB底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司。优级胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI1640购自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培养基购自SIGMA公司。PEG2000购自上海生工。
1.2??方法
1.2.1??rVVC的表达、纯化及复性：将pET28a(+)-vvhA-E.coli接种于含有卡那霉素(终浓度为25～30μg/mL)的固体培养基中37℃孵育，挑取生长菌落至含有卡那霉素(同上)的LB液体培养基37℃摇床培养。测菌体浓度，当OD值为0.6～1.0时，加0.5mmol/LIPTG诱导表达rVVC，振荡培养4h。11?000r/min离心收集菌体，加入PBS和少量溶菌酶重悬进行超声破碎，11?000r/min离心收集沉淀。沉淀用洗涤液?I(2mol/L尿素、10%Triton-100、20mmol/LTris-HClpH8.0)、洗涤液II(20mmol/LTris-HClpH8.0)、洗涤液III(去离子水)分别洗4、3、2次，12?000r/min离心弃上清。用SDS-PAGE检测洗涤效果。将洗涤后的包涵体用复溶液(8mol/L尿素、1%β-巯基乙醇、100mmol/LTris-HClpH8.0)充分溶解，12?000r/min离心取上清进行Ni2+-NTA亲合层析纯化。将层析后的收集液放入透析袋中透析，并将透析后的各组分进行SDS-PAGE检测纯化效果。用Broadford法对上述蛋白进行定量后，用550mmol/L盐酸胍充分裂解包涵体后，采用李桂军等[10]报道的方法，将复性液缓慢加入到已充分裂解的包涵体中，用复性液(55mmol/LTris-HCl、10.56mmol/LNaCl、0.44mmol/LKCl、0.55%PEG6000、550mmol/L盐酸胍、1.1mmol/LEDTA、440mmol/L蔗糖、550mmol/L精氨酸、1mmol/LGSH、0.1mmol/LGSSH)进行稀释复性后再经4℃三步透析复性。复性后蛋白溶液12?000r/min离心，上清冷冻干燥至干粉，-70℃保存。
1.2.2??免疫BALB/c小鼠和ELISA法检测：纯化复性后rVVC抗原用0.3%～0.4%的甲醛脱毒，4℃过夜。初次免疫rVVC与完全弗氏佐剂等量混合乳化，皮下多点注射;20d后第2次免疫，与弗氏不完全佐剂等量混合乳化，皮下多点注射;之后每隔10d免疫一次，均与弗氏不完全佐剂等量混合乳化，皮下多点注射。期间断尾采血，ELISA法检测免疫血清效价。达到效果后于融合前3d腹腔注射不含佐剂的rVVC抗原加强免疫。每次免疫抗原量为10μg。ELISA法测定时，用10μg/mLrVVC包被酶标板，4℃过夜。用含0.05%Tween-20的洗涤液洗板后，加入倍比稀释的免疫前与免疫后的小鼠血清(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1?600，1∶3?200，1∶6?400，1∶12?800，1∶25?600)，37℃孵育1h，洗板(同上)。加入1∶500稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h，洗板(同上)。加底物显色液(TMB)作用20min左右，用1mol/L的H2SO4终止其反应，酶标仪(Thermo)测定[11]。
1.2.3??SP2/0细胞培养：SP2/0细胞培养于含10%FBS的RPMI?1640培养基中，37℃，5%CO2细胞培养箱(Thermo3111)中培养。视细胞生长情况进行换液、传代或冻存。融合前SP2/0细胞用含有8-氮杂鸟嘌呤(20μg/mL)、20%FBS的RPMI1640完全培养液培养1周。
1.2.4??细胞融合和杂交瘤细胞的选择性培养：颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取脾，注射器法制备脾细胞悬液。脾细胞悬液经1?000r/min离心5min后，弃上清。沉淀中加入3mL4℃预冷的Tris-NH4Cl冰浴5min使脾细胞中混有的红细胞破裂，加入7mLRPMI1640基础培养液终止其作用，1?000r/min离心5min弃上清，沉淀用5mLRPMI1640基础培养液重悬，计数。处于对数期的SP2/0计数后，调整SP2/0与脾细胞的比例，以1:10进行混合，利用37℃预热的50%PEG2000，pH8.0促进其融合。融合后细胞接种于已铺有饲养细胞的96孔板，37℃，5%CO2培养箱中培养。融合当天用HAT培养液选择性培养，5d后观察细胞，视细胞生长状况HAT半换液。2周后换HT培养液培养1周，然后换成20%FBS的RPMI1640培养液，以后隔天半量换液1次。最后用10%FBS的RPMI1640培养。待杂交瘤细胞集落长至1/3每孔时，取细胞上清液用ELISA法检测抗体，对其进行初筛，并对阳性克隆孔及时冻存和克隆化培养[12]。
1.2.5??阳性杂交瘤细胞的克隆化及冻存：对阳性克隆孔细胞计数，调整细胞密度，用有限稀释法对阳性孔进行克隆化[13]培养，每孔细胞数约为0.8个。以SP2/0细胞上清液为阴性对照，间接ELISA法检测孔内细胞上清液。阳性孔重复以上步骤克隆化培养3次。抗体阳性细胞株连续培养期间用ELISA进行检测，并对每次克隆化的阳性克隆孔及时冻存。需冻存细胞用预冷冻存液重悬计数调整细胞密度为2～5×106/mL。分装至冻存管，2mL/管，做好标记。先置于4℃40min，-20℃1h，-70℃过夜，最后转至-196℃液氮罐保存。
1.2.6??单克隆抗体免疫球蛋白类型鉴定：取2mL阳性单克隆杂交瘤细胞培养上清液装入透析袋中，利用PEG6000，4℃包埋浓缩至0.2mL(浓缩10倍)时转至小管中，-20℃冻存备用。双向免疫扩散法鉴定分泌的rVVC单克隆抗体类型。中间一孔加10μg/mL的二抗(羊抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)，周边加PEG6000浓缩后的上清液，10μL/孔。
1.2.7??单克隆抗体特异性鉴定：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、产气荚膜梭菌超声破碎制备抗原，用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸缓冲液pH9.6)调节其浓度为50μg/mL，rVVC浓度为5μg/mL，包被酶标板。间接ELISA法测定阳性杂交瘤细胞培养上清的单克隆抗体特异性;同时用双向琼脂扩散法鉴定其特异性，方法1.2.6。中间一孔为抗原(上述五种抗原)，周边孔为浓缩后细胞上清液。
1.2.8??细胞复苏及抗体分泌稳定性测定：从液氮罐中快速取出冻存管，37℃水浴速融，加入10mL预冷的基础培养液，1?000r/min离心弃上清。加入含10%FBS的RPMI1640，37℃，5%CO2培养箱中培养。第2天时细胞换液继续培养，连续培养3个月。期间每半月用间接ELISA检测杂交瘤细胞分泌状况。
2??结果
2.1??rVVC表达及纯化效果??经IPTG诱导的pET28a(+)-vvhA大肠杆菌成功表达rVVC，产量约为细菌总蛋白的35%。菌体经超声破碎后离心，沉淀经洗涤液I、II、III洗涤后可得到较纯蛋白(见图1)，再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后由BandscanV5软件分析蛋白纯度，图2中标注8的泳道，目的蛋白纯度可达93%(见图2)。
2.2??小鼠免疫结果??重组溶细胞素包被浓度为10μg/mL，免疫后小鼠血清和免疫前阴性对照血清按1:100，1:200，1:400，1:800，1:1?600，1:3?200，1:6?400，1:12?800，1:25?600浓度稀释。结果判定，S/N值>2.1均为阳性。ELISA法检测结果(见图3)显示，血清有效稀释度为1:12?800。
2.3??杂交瘤细胞系的选择性培养结果??免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养基选择性筛选，融合率为31.11%，抗体阳性率为26.20%。经3次亚克隆，ELISA法筛选，得到2株稳定分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株B2C7与E3F4。图4为不同时间融合细胞生长情况。
2.4??单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚型鉴定??根据图5可知，B2C7和E3F4杂交瘤细胞株分泌的rVVC单克隆抗体类型均为IgG1。未见与其他类和亚类的交叉反应，由此可见获得的杂交瘤细胞为具有分泌单一抗体能力的单一细胞系来源的杂交瘤细胞。
2.5??单克隆抗体特异性检测??由间接ELISA法检测(见表1)得出E3F4和B2C7两细胞株分泌的单克隆抗体与rVVC抗原结合较强，几乎不与其他抗原反应，E3F4株细胞分泌的抗体特异性最强。双向琼脂扩散法检测发现，rVVC与细胞上清抗体之间有明显沉淀线，而与其他抗原无明显的反应(见图6)。
2.6??单克隆抗体分泌稳定性检测??由图7可知，获得的2株细胞，在复苏后的90d经EILSA法检测细胞培养液上清，抗体效价波动幅度不大，具有较稳定的分泌抗体的能力。
3??讨论
创伤弧菌是一种致病性极强的嗜盐性细菌，人一旦感染，短时间内就会引起伤口炎症，严重时会导致败血症的发生。创伤弧菌溶细胞素是其主要毒力因子之一，经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人类似的临床和病理表现，毫克级水平即可对实验鼠致死。我们利用IPTG诱导pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC，经纯化及复性后成功获得有活性的rVVC。在对表达后沉淀(包涵体)进行洗涤时发现，洗涤液(尤其是洗涤液I)洗涤包涵体对蛋白纯化非常重要，可提高Ni2+-NTA亲和层析对rVVC提纯效果。纯化后蛋白经复性后将正确的抗原表位表露出来，使制备的rVVC单克隆抗体能识别溶细胞素的抗原表位。经表达、纯化及复性后得到的rVVC对溶细胞素单克隆抗体制备、致病机制及免疫性研究提供了有利条件。利用基因工程获得rVVC蛋白方法简便，且高效，获得的rVVC的毒性与自然表达的溶细胞素相比毒性较低，再经甲醛脱毒后可在此基础上消除毒性，但保留其免疫原性，可相对增加每次的免疫剂量，从而提高免疫成功率。
脱毒后重组溶细胞素抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化，佐剂可以减慢抗原的降解，使抗原在免疫部位缓慢、持久释放，从而提高巨噬细胞对抗原的摄取效率，促进抗体的产生，提高免疫效率。诱导免疫小鼠对抗原产生良好的免疫反应，亦即融合所需B细胞群中必须含有能分泌研究所需的特异性抗体的B细胞，而且数量越多、比例越高越好。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度与亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。
本实验成功获得rVVC抗体阳性的杂交瘤细胞株B2C7和E3F4株，其可持续稳定分泌rVVC单克隆抗体。B2C7和E3F4株单克隆抗体均为IgG1类，这将有利于标记二抗的选择及建立相应的免疫检测方法。ELISA法检测结果证实，B2C7和E3F4单克隆抗体有较高的特异性，与多种细菌超声破碎抗原无反应。本实验结果为进一步深入研究VVC的致病机制及研发针对创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测的试剂盒具有重要意义。
参考文献
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简述克隆培养法的基本原理篇5
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关键词教材插图复习教学生物学教学
中图分类号G633.91文献标识码B
1高考复习后期回归教材的必要性
在高考生物复习阶段，教师往往会看到这样的一种现象：有些学生漠视教材，不愿回归教材，甚至上课也不带教材。结果学生在各种考试和测验中难题没少拿分，但简单的试题失分较多，而且导致信心不足。
高考生物命题一直立足教材。如：2013年浙江理综卷的试题：实验小鼠皮肤细胞培养（非克隆培养）的基本过程如图1所示。下列叙述错误的是（）
A.甲过程需要对实验小鼠进行消毒
B.乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化
C.丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型
D.丁过程得到的细胞具有异质性
【解析】：本题是浙科版生物选修3教材29页图2-6动物成纤维细胞的培养过程的变式。
教材中对动物细胞培养的叙述是：“首先，将动物体内的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个的细胞。”教材图中标注“胰蛋白酶酶解，消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分，获得单个的成纤维细胞悬浮液”。进行组织取样前需要对采样部位进行消毒，这是无菌操作的基本要求，对应教材中的“从消毒的根、茎或叶上取一些小组织块”。故A和B选项正确。丙过程属于原代培养，丁过程属于传代培养，教材中提及：“原代培养物在首次传代时就成为细胞系，能连续培养下去的细胞系称为连续细胞系，不能连续培养下去的细胞称为有限细胞系。二倍体细胞通常为有限细胞系。连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型。”“把一个细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，叫做克隆培养法或细胞克隆。未经克隆化的细胞系具有异质性。”
小鼠是二倍体生物，培养细胞1属原代培养产物，并非连续细胞系，此时的细胞的核型稳定；而培养细胞2为传代培养产物，因为未经克隆培养，细胞会出现异质性，因此C选项错误，D选项正确。
答案：C。
这种重基础、求和谐的特色既能使命题基本稳定，又能正确引导中学生物教学。因此，教师在生物高考复习的后期，应回归教材，充分发挥教材的示范作用，系统地掌握基础知识和基本方法，掌握知识间的横向和纵向联系，领悟思想方法、关注细节和规范、可促进提高复习的效率，促进高考的有效增分。
2生物教材中插图的类型与特点
高中生物教材中插图的表现形式丰富多彩，目前对教材插图的分类，还没有一致的意见。不同的研究者从不同的研究角度划分不同的类型。从外在形式上分，生物插图可分为实物图、模式图、示意图、表格图、统计图、人物图、实验装置图等（表1）。
3利用教材插图复习的现状
图文并茂是生物教材的一个重要特点。教材注重以图代文，简明直观。教师利用教材插图进行高考复习，可以帮助学生掌握相关生物学知识；促进学生理解和记忆知识；帮助学生把握重点、突破难点；促使学生形成集中化、网络化的知识；此外还有助于学生的处理信息和收集信息能力的形成。但事实上一项调查结果则表明，当今大多数学生对教材插图不熟悉、缺乏基本的图像素养，根本没养成自觉看教材插图的习惯，更谈不上运用插图解决实际问题，这无疑与教师的用图意识有关。调查发现：在复习阶段，7.84%的教师会主动利用教材插图；35.29%的教师经常用教材插图或图表组织复习；39.22%的教师偶尔使用插图或图表组织复习；17.65%的教师很少主动利用插图或图表组织复习。
因此，教师利用教材插图的组织复习，提高学生的用图意识，为学生做好示范，显得非常有必要。
4利用教材插图进行高考复习的案例
笔者在复习中采用的方法是依据考试说明中的知识内容要求，按照教材中的顺序，对插图逐幅呈现，采用师生互问、生生互问的方式促进学生积极学习，揭示和挖掘图片中包含的显性与隐性的生物学信息，尽量做到由图及文，图文结合（表2）。
5学生对教材插图复习的评价
学生甲：我个人觉得回归教材是蛮有必要的，结合教材图片可以找到很多的漏洞。比如，我一直没有弄清楚动作电位的图像和动作电位传导的图像，一直带着误区在做题目，而且没怎么查出来。后来回归教材的时候才发现自己从一开始就没有弄清楚这个知识，最起码回归教材可以温故知新。
学生乙：教材图片复习教学的视觉效果远远好于文本复习教学，给人以更深刻的印象；图片复习在十分困顿的高三时期密密麻麻文字中给人以耳目一新的效果，可以提高我们的专注度；图片教学的基础性是很强的，主要针对教材内知识的复习；图片教学的系统性不如文字，对于那些善于文字系统记忆的同学有些吃亏；图片课堂教学的缺点在于，同学一旦走神，就没什么感觉了，其损失远远大于文字教学（毕竟文字复习还可以抄好回去慢慢想）。
学生丙：通过插图来复习生物，最大的感受就是可以关注到很多原本被忽略掉的小细节，另外对于教材重点内容的识记，通过结合插图可以做到记得更快，而不是死记硬背。例如线粒体的结构，必修一上的插图很清楚，看到图就能想到嵴向内折叠增加膜的面积等。建议对于插图的复习，也没有必要张张俱到，也就是捡着重点插图复习就已经足够。一些“冷门”的插图关注的意义不大，就没有必要多费时间。我有一个想法，可以让学生专门进行一次对教材插图自己整理的活动，自己来整理比老师讲的效果更深。考虑到保证质量，可以定期让学生整理一部分，甚至可以让每个学生整理一块内容，拿到课堂上交流，适当的地方时候由老师进行补充。
参考文献：
简述克隆培养法的基本原理篇6
一、小学生论辩要培养的主要能力
小学生的论辩能力，更多地要在阅读教学中培养，在口语交际中提高。阅读活动中的论辩是以石击石的火花迸射，是以情激情的心潮相逐，在阅读教学中，要培养学生的概括、复述、补充能力，质疑、答辩、反驳等能力。
听别人说话要抓主旨，悟含蕴，在理解上下工夫，做到边听边思边记，然后在此基础上进行概括、复述或补充。
质疑、答辩，是以智慧开启智慧的相互造就，答辩是在公开、正式的场合所进行的论辩，是用生命点燃生命，它能培养人完整的语言表达能力和逻辑思维能力，因此，平时要经常开展论辩活动，培养学生的答辩能力，遇到一些需要论辩的场合，能应付自如。
反驳是论辩中所采用的方法之一，用反驳可增强语言气势，应经常训练学生从反面思考，而思考的过程也正是立论的过程。
二、培养小学生论辩性语言的策略探究
1.尊重学生，树立信心。
小学生由于年龄特点和心理特点所限，很希望老师能把他们当成具有独立能力的个体来看待，希望得到老师的尊重与信任，希望和老师关系平等。教师要放低姿势，常常以商量、“求教”的口吻和学生探讨问题。笔者在教学中，常说的一句话是：“这个问题老师还没想透，你能教教我吗？”在这样的氛围中，学生很有自信。当一个学生“教”了老师以后，如果没有到位，笔者就会接着问：“还有哪位再教教老师啊？”如果，他们说对了，笔者就很开心地说：“你教得真好，我记住了。”如果学生讲得不太理想，笔者常说：“你这么一说啊，给了很好的启发，我想到了……”然后，对学生所说加以纠偏、圆融，接着让别的学生复述、强化。如果学生说错了，笔者就会这样说：“我原来是这样想的，今天听你这么说，我很想听一听，你为什么这样说啊，我们俩‘斗斗嘴’，让大家评评，好吗？”然后进入师生论辩状态。当然，一些简单的问题论辩，笔者通常都是搬“救兵”――学生，笔者会说：“谁能帮我和那位同学辩一辩？”长此以往，全班学生都会参与到论辩中。
2.循序渐进，巧设疑点。
开展论辩教学，使单向式交流变成双向式多向式交流，这样的教学情境势必加倍和谐、亲切，课堂气氛更加生动活泼，同时也加强师生间的交流，教与学互相反馈，教学效果事半功倍。但课堂论辩也易出现众说纷纭、难以收场的局面，为了加快课堂的节奏，论辩前，教师要提醒学生集中思想，以表情、手势加强语势。初期辩论学会条理化，在推进中学会小组合作，集中材料，集中要害，大容量、快节奏地形成凌厉攻势，最后形成“在战术上重视敌人”、“在战略上藐视敌人”的“自知”和“自信”。
例如：苏教版三年级下册《你必须把这条鱼放掉！》这篇课文可设计这样的辩题：汤姆是应该把鱼放掉呢？还是把鱼带回家？赞成放掉的一组，赞成拿回家的一组。课后思考准备，提示学生注意选取、收集自己的论据，可以从课文中找，也可以引用生活中的句子或实例。课上论辩总结。设计这个论辩，是希望学生由彼及此，从文章到现实生活。文章来源于生活，联系生活又加深了对文章的理解。在争辩中，进一步明白公共秩序是需自觉遵守的。这样的论辩，不仅训练了学生的能力，而且激发了学生的兴趣，让学生在论辩解疑中把握作者的思想脉搏和匠心独运的写作方法，从而更好地正确理解课文。
在课堂教学的提问中穿插一些问题作为辩题，先问赞成还是不赞成，并说出原因，这样，让学生在不知不觉中进入论辩角色。论辩能发挥智慧潜能，展现独特个性，使学生的语文水平在论辩这一形式中“无痕”地不知不觉地得到提高，知其然而不知其所以然的问题及大有争论的问题应是设疑、质疑的重点。
如：苏教版五年级下册《奇妙的克隆》一课，在介绍克隆知识和“假如我会克隆，克隆什么？为什么克隆这个？”想象说话的基础上，可请持不同意见的双方围绕“克隆技术造福人类”的辩题展开讨论。讨论后加以小结：科学发展是必然，克隆突破为造福，观念可以讨论，我们希望“克隆技术造福人类”，我们更“严肃地考虑它的含义，并展开科学讨论，用以教育世界人民”。
3.规范训练，持之固之。
纵横家的鼻祖鬼谷子说：“辩之，明之，持之，固之。”通过论辩能刺激同学的思考，培养学生的思维能力，对别人的观点即时作出回应和反驳，而这种能力的获得不是一朝一夕就能得到的，要规范训练，“持之”才能“固之”。
笔者常常利用语文实践课请部分语文教师作为评委，按照论辩比赛规则，举行论辩活动。笔者先出示几个辩题让学生选择其中一个，或者共同商定另外一个有争论的题目，准备论辩。论辩前要指导学生采用一些论辩技巧，如控场技巧、证明技巧、进攻技巧、防卫技巧等。论辩开始时，各人表明基本观点，根据基本观点分成两组，确定正方、反方，双方各抒己见，展开论辩，经过激烈角逐，最终评出最佳辩手。这样的论辩可分小组进行，也可全班进行，论辩以后要认真总结，评议答辩过程，肯定双方说得对的地方，从而对问题有较全面的认识。